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　　原标题：【Nature Protocols】系列：定向分化多能干细胞生成远端肺类器官

　　该成果描述了一种定向分化人多能干细胞为远端肺类器官的方案，将hPSC（胚胎干细胞和诱导多能干细胞）定向分化为3D肺类器官用于研究间质性肺疾病、病毒感染和人肺发育。

　　类器官是干细胞研究中令人兴奋的进展阶段。研究者们成功地开发了一种方法，可以将hPSC（胚胎干细胞和诱导多能干细胞）定向分化为3D肺类器官。这个过程类似于分支形态发生，并可以用来模拟纤维化间质性肺疾病和病毒感染。

　　该方案通过将人类多能干细胞依次确定为最终的内胚层、前前肠内胚层、腹侧前前肠内胚层、肺芽类器官，最后是肺类器官，来概括肺的发育。类器官需要大约40天的时间来产生，并且可以维持180天以上，同时逐渐成熟到与人类妊娠中期一致的阶段。肺上皮由多种细胞类型组成，包括气道中的基底细胞、纤毛细胞、分泌细胞、杯状细胞和神经内分泌细胞，以及肺泡中的AT1和AT2细胞，它们负责气体交换。

　　它们的特点在于分支形态，几乎没有非肺内胚层谱系，同时具有间充质细胞的存在和再现间质性肺疾病的能力；此外该方案操作简便，可由任何熟悉细胞培养技术的人在无血清条件下进行，不需要谱系特异性报告细胞或富集步骤。

　　研究人员在培养细胞上维持 hPSC。实验开始时先消耗小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）（d1，图 1b，i），然后按先前描述的步骤依次诱导 DE（d0-4，图 1b，ii）和 AFE（d5-6，图 1b，iii）。消耗 MEF 后，在超低附着力平板的胚状体/原始条纹（EB/PS）培养基中进行原始条纹和胚状体诱导 12-16 小时（步骤 14-27）。然后转到 DE 诱导培养基中再诱导 76-80 小时（d4；步骤 28-42）。这一步骤的关键是暴露于高浓度的激活素A中。DE既可在二维附着培养基中生成，也可在三维低附着平板中作为EB生成。研究人员发现，肺潜能在 EB 中保持得最好。

　　在对 EPCAM、cKIT 和 CXCR4 进行染色后，通过流式细胞术验证 DE 的纯度（步骤 43-66），必须有 90% 以上的细胞高水平表达这三种标记物。此外也有人建议使用商业试剂盒生成 DE。但研究人员发现，虽然生成 DE 的效率很高，但这些 DE 细胞生成肺和气道细胞的潜力较为有限。高纯度的DE(90%)分别通过SB 431542, NOGGIN和IWP2抑制TGF-β， BMP和WNT信号传导而直接作用于AFE(步骤67-89)。在 AFE 诱导结束时（d6），在 BMP4、FGF10、FGF7、全反式维甲酸（RA）和糖原合酶激酶 3β 拮抗剂 CHIR 的存在下，用腹腔化培养基处理细胞 48 小时（步骤 90-92）。此时，可观察到松散粘附团块的形成（图 1b，iv）。

　　接下来生成 LBO（步骤 93-99）。方法是在 d8 时重新悬浮细胞团块，并在 CHIR、FGF10、FGF7、BMP4 和 RA 的作用下将其保存在超低附着力平板中【Nature Protocols】系列：定向分化多能干细胞生成远端肺类器官，使其形成由夹杂着间充质细胞的折叠上皮片组成的球体（图 1b、v、vi 和图 3b）。大部分上皮细胞表达早期肺标记，但不表达成熟肺标记，其表达谱与肺芽上皮一致。间充质细胞表达的标记与肺间充质一致，通过流式细胞术可占细胞总数的 5-20%。

　　图2 含有FBS的培养基不能维持类器官培养。亮视野图像的Tile扫描显示d47类器官转换为含FBS的培养基的形态变化。比例尺，1毫米。

　　图3 类器官的成熟和可包埋的悬浮类器官的选择。a，在RNAseq研究中诱导选择的AT2标记物。b，d20 LOB的代表性图像。上面一行显示的类器官因为密集的中心和空心结构而不被选择。下面一行显示了“良好的”类器官，具有可折叠的上皮结构，中心清晰透明。

　　在最后阶段(步骤100-117)， LBO在基质胶中镀上CHIR、FGF10、FGF7、BMP4和RA，在此过程中，LBO 向外出芽，随后发生类似分支形态发生的过程(图1b, vii, viii)。也可以使用其他替代品，如 Cultrex（R&D Systems），研究人员使用后也得到了类似的结果。推荐使用减少生长因子的基质胶，因为不同浓度的多种因子可能会不可预测地影响类器官的发育，从而影响可重复性。间充质包埋于基质胶后逐渐消失。大约90%的LBO将产生快速扩展的分支结构，其中表达AT2标记的细胞比例逐渐增加，从而到d80时，这些细胞就占了大多数。

　　类器官可在体外培养6个月以上。整个研究方案在无血清条件下进行。研究人员发现一些培养基成分需要大量测试。这些包括激活素A, N2和B27培养基和敲除血清替代。批量测试包括通过流式细胞术评估 EPCAM、cKIT 和 CXCR4 的表达，对 DE 生成的最大效率进行比较分析。研究发现无需对基质胶进行批量测试以确定是否能形成类器官。培养物可以在分化的任何步骤使用几种方法进行分析，包括免疫荧光、逆转录定量聚合酶链反应、电子显微镜、RNAseq和蛋白质印迹等(图5、6)。

　　此外，培养物可以通过scRNAseq进行分析。由于输入的单细胞悬液的质量对scRNAseq至关重要，因此该研究提供了从基质胶中的类器官组织生成单细胞悬液的方案(图7、8)。

　　图4 Col I凝胶内嵌的肺类器官的形态学。对一个亮区图像的Tile扫描显示了在Col I凝胶中生长的d50类器官的形态。比例尺，1毫米。

　　图5 在不同阶段的类器官的IF分析。a, Tile扫描图像在d8(腹化)染色指示标记。b，培养方案d20培养LBOs的Tile扫描图像和高倍视野(插图)。c-e，共聚焦扫描~d60类器官，标记标记，高倍图像(右)对应编号框。除d插图(上250 μm，下200 μm)和c、e插图(100 μm)外，a-e中的所有比例尺均为500 μm。

　　图6 对肺类器官的核心和尖端区域的RT-qPCR分析。a，上图显示分离核心(虚线区)和尖端之前的类器官形态。下图显示了一个类器官的核心(左)和尖端(右)。b，选择肺和非肺内胚层标记的RT-qPCR在中心相对于类器官的外围(n = 3个独立实验，在~d60，双向方差分析)。

　　图8 合并scRNAseq分析。a，对d25、d40、d60和d80收集的类器官进行合并(而不是整合)分析后的UMAP聚类，显示每个图顶部的每个标记的表达。每个时间点对应的集群显示在左上角的图中。b、scVelo轨迹分析。集群由颜色识别。利用scVelo对合并后的数据集进行伪时间分析。

　　图9 LBO形成的故障排除。a，在提升细胞产生LBOs之前，不同的板层密度对心室化AFE期(d8)形态的影响。b，在面板上方的不同阶段，通过Ki67和7-AAD染色来测量增殖。如框2所述生成d35时的单细胞悬液。c, LBOs悬浮培养超过25天产生的流产类器官。比例尺为c, 250 μm。

　　关于本研究中实验操作的120项具体步骤，小学社将在下期推文中为大家详细讲解！