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　　1、 摘要:胚胎干细胞包括来自囊胚内细胞群的ES细胞和来自胚胎原始生殖嵴的EG细胞,其中ES细胞维持不分化传代培养已达80代。由于这些细胞具有高度复制能力及多向性分化潜能,近年来的研究使人们对胚胎干细胞的培养条件胚胎干细胞-综述、表面分子标记和鉴定方法、诱导分化及其应用前景,以及当前研究方面存在的主要问题有了进一步的认识。关键词:ES细胞;EG细胞;培养;应用引言 干细胞是一种具有无限自我复制能力和向多种细胞分化潜能的细胞。它包括胚胎干细胞和成体干细胞,前者指早期胚胎的多能干细胞(pluripotent cell),后者指在己特异分化的组织中具有干细胞特点的细胞如造血干细胞、成骨干细胞、神经干细胞等。在过去的20年中,由于培养技术、分离技术的提高以及对干细胞特征如细胞表面抗原、遗传标记认识的加深,鼠和人的干细胞己建系上百株。无论胚胎干细胞还是成体干细胞均己展示出很好的临床应用前景,同时也将为基因功能研究、药物研究提供良好的工具。所以干细胞研究已成为生命科学的研究热点。本文作者主要就胚胎干细胞的研究进展作一综述。1ES细胞 从受精开始,两个高度分化的生殖细胞、卵子结合成双原核的受精卵,双原核受精卵不是干

　　2、细胞,但它是真正的全能细胞(totipotent cell),能分化成机体及相关组织如胎盘的所有细胞。在小鼠受精后3.5天、人受精后5天,胚胎发育至囊胚阶段,经历第一次分化,胚胎分化出内细胞团细胞(inner cell mass,ICM)和滋养层细胞(trophetoderm cell,TE)。其中ICM能培养成ES细胞(embryo stem cell,ES),它能自身复制,也能够分化包括生殖细胞在内的多种细胞,是多能干细胞。20世纪80年代初期,两组科学家几乎同时分别直接从鼠囊胚中分离出ES细胞1,2。这些细胞在白血病抑制因子(leukemia inhibiting factor,LIF)存在的条件下可维持不分化而自我复制。此后,科学家们一直致力于家畜及人类的ES细胞系的建立。直至1998年,Thomson等3首次报道在体外受精5天的人囊胚中成功分离出hES细胞,体外培养维持不分化状态均传代30代以上,开创了胚胎干细胞研究的新纪元。 2EG细胞 胚胎干细胞的另一重要来源是胚胎原始生殖嵴细胞,又称胚胎生殖细胞(embrionicprimordial germ cell,EG细胞)。内

　　3、细胞团形成后,首先分化成原始内胚层(primitive endoderm),接着分化形成外胚层(epiblast)的生殖层(germlayer),它是未来男、女性生殖细胞的前体。随着胚胎发育,这些细胞迁移至生殖嵴。当原肠胚形成(gastrulation),ICM分化多能性消失,而EG细胞分化多能性能则维持较长时间。 1992年,两组科学家直接从受精后812天的鼠胚中成功分离出mEG细胞4,5,事实上,这些细胞有的来自迁移至生殖嵴前的生殖层细胞,有的是在上述细胞迁移至生殖嵴后获得1998,Shamblott6率先报道了从受精后59周的人胚胎中成功分离出hEG细胞并建系。在体外分化潜能方面,EG细胞具有ES细胞的很多特点,与hES细胞成功分离建系一样,hEG细胞系的成功建立成为1998年生命科学研究的重大事件。 3胚胎干细胞的分离培养条件 小鼠胚胎干细胞体外分离、培养条件的探索为人胚胎干细胞的研究提供了丰富的经验。目前hES、hEG细胞分离、培养基本采用了类似小鼠的方法,即采用免疫外科分离方法,从囊胚分离ICM,在无Ca2+、Mg2+的培养液中将分离出的ICM置于饲养细胞上(feeder

　　4、cell),饲养细胞多为经过照射,不能进行有丝分裂的鼠成纤维细胞3。最近亦有人成纤维细胞作为饲养细胞的报道7。EG细胞的获得多采用机械研磨加酶消化的方法,将特定时期的胚胎细胞转至有饲养层细胞的培养条件中6。人和鼠胚胎干细胞体外培养维持不分化所需的细胞因子不同,mES、mEG细胞需要LIF存在,LIF与LIF受体与膜蛋白gp130受体形成的异质性受体二聚体结合,激活受体相关的JAK蛋白激酶,使受体及相关蛋白磷酸化,从而促进转录因子STAT3二聚体形成并转移至核内,通过它与DNA靶部位结合,控制分化基因的转录,促进自我复制8。维持hES、hEG细胞不分化的因素不是LIF而是鼠胚胎成纤维细胞9。但具体通过何种机制作用,目前尚不清楚。此外,hES、hEG细胞培养液中还需要成纤维细胞生长因子(fi-broblast growth factor)维持其生长,而mES、mEG细胞不需要3。目前报道的培养条件可允许hES细胞维持不分化至80代10,hEG细胞30代。 4胚胎干细胞的分子标记及其鉴定 胚胎细胞在发育的不同阶段,其细胞表面出现不同的抗原,又称分子标记。胚胎干细胞的分子标记是指在胚胎干细胞未

　　5、分化状态下高度表达,一旦分化,基因迅速降调甚至关闭。这些标记物加上干细胞时期细胞内碱性磷酸酶、端粒酶的特异性高表达,可成为鉴定胚胎干细胞的依据。hES与mES细胞的分子标记研究较为清楚,两者间分子标记有明显差异11,见表1。 表1不同时期胚胎hES与mES细胞表面分子标记比较Table1Compare of molecular mark satdifferent phases of hES and mES cell development 分子标记胚胎期28细胞期桑椹胚ICM滋养细胞 hES细胞SSEA1-+-+SSEA3-2+SSEA4-2+TRA-1-60-3+TRA-1-81-2+mES细胞SSEA1+2+SSEA3+-SSEA4+2+-TRA-1-60*-TRA-1-81”A-l-81-*细胞表面没有,但透明带内面存在至今已发现在人胚胎未分化多能干细胞表面有13种分子标记。目前对这些分子标记的研究深度、了解程度基本可归纳为以下两种情况:分子标记物基因序列清楚,并已克隆,如基因库中NM-Sox2等;只是应用抗体检测能测得细胞表面抗原,其特征还需进一步了解12 ,如SEA-3,SE

　　6、A-4,RA-1-60,RA-1-81,RA-2-54,CTM-2等。 5胚胎干细胞的诱导分化 在体外培养条件中如果不加LIF,mES分化在缺乏成纤维细胞饲养层或培养皿中细胞增多堆积时,hES、hEG细胞呈自然分化。目前已有报道,在培养皿中撤去成纤维细胞饲养层,hES、hEG细胞经过35天的培养,便分化形成胚体(embryo bodies),胚体中有来自外胚层的神经细胞、上皮细胞,来自中胚层的造血细胞、横纹肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞、软骨细胞、内皮细胞和来自内胚层的胰岛细胞3。体内研究表明,将mES细胞注入小鼠腹腔内,可形成含有三胚层组织的畸胎瘤,这种畸胎瘤细胞核型仍为二倍体,无恶性病变。将hES、hEG细胞注入免疫缺陷鼠皮下,可观察到含有人三胚层组织的畸胎瘤生长13 。由于对ES、EG细胞分化形成器官潜能的分子机制了解不多,虽然有神经细胞、胰岛细胞、心肌细胞的诱导分化成功,但定向诱导分化仍然是当前需要解决的问题。这需要密切跟踪细胞分化的每一步骤,了解细胞终末分化之前经历的中间过程,通过对正常发育过程的了解,帮助建立多种细胞体外诱导分化的条件。 6胚胎干细胞的应用前景及主要问题 由于

　　7、胚胎干细胞的高度复制能力及多向性分化的潜能,已展示出很好的研究、应用前景。如将特殊改变的基因转导至ES细胞中,体外选择后将ES细胞导入机体,使ES中的遗传信息传达给子代,可能有助于克服出生缺陷,纠正某些遗传性疾病14 ;将经过基因修饰过的ES或EG细胞与正常细胞放在一起形成嵌合体,研究发育进程中细胞与细胞之间相互作用对细胞突变的影响15;将ES或EG细胞中某个基因敲除或将外来的某个基因导入,研究特定基因对胚胎发育、药物代谢和肿瘤形成的影响等1618 。最近有人用RNAi的方法使hES细胞中某个基因表达下降,获得较稳定的结果19。科学家们认为有希望通过该方法创建免疫无反应的hES细胞系,从而控制hES细胞移植后的排斥反应,使hES细胞移植易于成功。人胚胎干细胞研究有望为目前临床某些难治性疾病提供治疗的新方法甚至治愈的可能性。如可将hES体外诱导分化的心肌细胞导入心室壁,替代己梗死的心肌功能20;应用体外分化的胰岛细胞治疗1型糖尿病19;应用诱导分化的神经细胞前体细胞治疗帕金森病22。有人预言,将来可应用胚胎干细胞在体外形成的器官取代功能衰竭的体内器官,为提供重要的来源保障。当然要

　　8、实现胚胎干细胞的临床应用,还要做很多工作: 需要研究阐明胚胎干细胞基因组印迹状态(genomicim printing)。基因组印迹是某些等位基因的表遗传修饰,与胎儿发育异常及肿瘤生长有关。在个体发育不同时期,基因组印迹状态不同。己有研究表明,鼠胚胎干细胞基因组印迹异常或不稳定23;但另一组研究者则发现人和小鼠EG细胞的基因组印迹基本正常,这可能为胚胎干细胞临床应用排除了一大障碍24。但对hES细胞的研究尚未见报道。 需要解决免疫排斥问题。研究表明,与其他同种异体的组织相比,虽然hES、hEG细胞移植的排斥反应较轻,但它仍不可避免地会发生。供者与受者ABO血型抗原、HLA组织相容性抗原、微组织相容性复合物抗原(minor histocompatility complex antigens MHC)的不同而诱发排斥反应25。解决这一问题的可能途径有:a.通过减少同种异体间抗原的差异来减轻排斥反应。目前己有很多科学家呼吁建立干细胞库,移植前对供者-受者进行基因型配型,用基因型相近的供者干细胞移植。b.基因组替换(genomic replacement)。将受者的体细胞核注入去核的成

　　9、熟卵细胞胞质中,在体外培养、受精,让其发育成胚胎干细胞,诱导分化,然后移植26,27 。c.长期免疫抑制药物治疗。d.进行hES、hEG细胞的基因操作,使与排斥有关的抗原如MHC细胞表面抗原和相关细胞如细胞表面抗原和相关细胞如CD95细胞减少28,29 。 胚胎干细胞的定向分化及分化细胞的分离纯化。胚胎干细胞的有效定向分化是今后干细胞研究的主攻方向之一。这需要基因组学、基因功能学、分子生物学和细胞生物学等专家的共同努力。此外,为保证细胞移植受者的安全,用于临床的己分化细胞的分离和纯化也是重要的研究课题。 安全性的考虑。无论hES还是hEG细胞培养过程中需不同物种的细胞及细胞因子参与如鼠胚胎成纤维细胞,若某种病毒虽正常寄生在鼠体内,但却能引起人发病,这将对受者构成极大威胁。因此,胚胎干细胞的研究进展培养液中的饲养层细胞最好用人成纤维细胞,最近己有采用特殊基质(Matrigel)替代饲养细胞的报道9。参考文献:1EvansMJ,KaufmanMH.EstablishmentincultureofpluripotentialcellsfrommouseembryosJ.Nature,1981,292(5819):154-56.2MartinG.Isolationofapluripotentialcelllinefromearlymouseem-yosculturedinmedium

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