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　　PAGE PAGE PAGE 1 题目名称：胚胎干细胞的研究进展与发展前景 目录 TOC \o 1-1 \h \u 9094 题目名称：胚胎干细胞的研究进展与发展前景 Ⅰ 摘要 Ⅰ 关键词 Ⅰ 26957 前言 4 12730 1.ES细胞的基本概念及其研究历史 4 2531 2胚胎干细胞的特性 4 29578 2.1在体外遗传下的高度可操作性 4 3291 2.2全能性 4 30728 2.3在体外培育下的无限增殖性 5 9046 2.4种系传递性 5 25697 3几种家畜ES细胞的研究进展 5 31760 3.1牛ES细胞的研究进展 5 31105 3.2猪ES细胞的研究进展 6 29922 3.3羊ES细胞的研究进展 6 4 ES细胞的应用前景 6 4.1克隆动物 6 4.2转基因动物 7 4.3性别控制 7 5小结 7 9235 参考文献 8 致谢 9 PAGE PAGE 1 胚胎干细胞的研究进展与发展前景 姓名：徐长志 专业：动物科学与技术 指导教师：孙永峰 摘要：现如今，胚胎技术已经在动物繁殖育种中得到了广泛的运用，并且胚胎干细胞的研究也已实现了各种突破，胚胎干细胞所具有的无限增殖、自我更新、多向分化的特性，使其在各种研究中被广泛使用。本文将会对胚胎干细胞的研究进展与发展前景进行综述。 关键词：胚胎干细胞、全能性、多样性、繁殖育种 Research progress and development prospect of embryonic stem cells Name：XuChangzhi Major：Animal Science Tutor：SunYongfeng Abstract: Nowadays, embryo technology has been widely used in animal breeding, and the research of embryonic stem cells has achieved a variety of breakthroughs. Embryonic stem cells have the characteristics of unlimited proliferation, self-renewal and multi-directional differentiation, which make them widely used in various research. This article will review the research progress and development prospects of embryonic stem cells. Key words: embryonic stem cells, totipotency, diversity, reproduction and breeding Ⅰ PAGE PAGE 4 前言 胚胎干细胞（简称Embryonic stem cell、ESCs、ES、EK或ESC细胞）是由初期胚胎或原始性腺分离的多功能性细胞的一种，具有无限增生、自我更新和多方向分化的特性。由于这些特性，胚胎干细胞无论在体外还是体内，胚胎干细胞都有无限增生、自我更新和多方向分化的特性。都可以被诱导分化成机体几乎所有的细胞类型，即全能性。1981年Evans和Kaufman首次成功分离了小鼠ES细胞，证明了小鼠ES细胞可以分化成心肌细胞、造血细胞、卵黄囊细胞等。人类的ES细胞也可以分化成神经细胞胞、滋养层细、心肌细胞、造血细胞等。这些都说明了ES细胞无限的可能性。 近年来，随着动物胚胎干细胞的应用逐渐扩大，其无限的可能性也逐年显现。在初期胚胎的发育中，ES细胞起着非常重要的作用。ES细胞也是克隆动物[3]、嵌合体生产[4]、基因目标打靶[5]和转基因动物生产[3]研究的有利工具。另外，根据近年来的研究，ES细胞由于能使基因组转移到下一代，ES细胞很有可能成为控制家畜生殖细胞系统的最有利手段。 1.ES细胞的基本概念及其研究历史 胚胎干细胞的研究起源于20世纪70年代畸形胚胎瘤的研究，研究者将老鼠的初期胚胎移植到成年老鼠体内后，产生了恶性畸形胚胎瘤。根据研究，畸形胚胎瘤内的细胞可以在体外自我更新，分化成不同种类的细胞。这种类型的畸形胚胎瘤，因为只能由老鼠着床前的初期胚胎产生，所以推测这种可以在体外自我更新的细胞，是由胚胎发育初期短暂出现的外胚产生的。根据畸形胚胎瘤细胞的研究，研究人员认为，从老鼠的初期胚胎可以分离出能够分化成多种细胞类型的全能性细胞，即胚胎干细胞（ESC）。2001年，美国国家卫生院针对Austin Smith对鼠ES细胞的研究，针对这个概念提出了标准[7]。自从1981年Evans和Kaufman将胚胎内细胞团（ICM）的胚胎干细胞分离出来后，世界范围内胚胎干细胞的研究便开始盛行起来。 时至今日，研究人员通过不懈的努力已经成功确立了老鼠[8]、老鼠[9]、猕猴[10]和人[11]的ES细胞库。ES细胞的研究中，关于猪和牛等大家畜ES细胞的报告很多，但是到现在为止还没有确立它们的ES细胞系。如果能使猪、牛、羊的ES细胞系成功建立，这将会对初期胚胎发育的研究非常有利[1]，在转基因、克隆新品种、繁殖育种等领域有广泛的应用前景，对于加速良种的培养也有重要的理论意义和实用价值。 2胚胎干细胞的特性 2.1在体外遗传下的高度可操作性 ES细胞可以在身体外进行很多遗传因子操作。例如，通过导入外源的遗传因子，用同源重构的原理和方法，插入或删除某个特定的遗传因子；还可以诱导遗传因子的突变。理论上，ES细胞通过遗传操作仍然可以保持其发育的全能性，因此ES细胞可以应用于转基因家畜的生产，可以对突变或过度表达的纯合子或杂合子个体进行基因功能的分析。 2.2全能性 ES细胞具有非常高的分化潜能，可以分化包含3个胚层的各种各样的细胞。在研究小鼠畸胎瘤的过程中，研究人员发现，将ES细胞移植到有生物免疫缺陷的老鼠身上，由3个胚层构成的畸形瘤就会在体内产生。并且根据研究证明，如果从多能细胞培养系统中除去抑制分化的因子，一部分细胞便会自发分化，形成内皮细胞、血细胞、肌肉细胞、神经细胞等不同种类的组织细胞。 2.3在体外培育下的无限增殖性 ES细胞虽然可以通过体外培养会扩大数量，但是前提是必须在没有分化的状态下进行胚胎干细胞的研究进展与发展前景docx。其增生速度非常快，每隔18～24小时一次。另外，ES细胞在体外的适当条件下能稳定传代，有保持长期的培养和发育的潜能。 2.4种系传递性 ES细胞具有全能性，但是如果直接移植到动物体内，是不能成为胚胎的。但如果将ES细胞通过注射移植到受体胚胎中，融合后移植到人工妊娠母体的子宫内发育的话，就可以参加宿主胚胎的各组织器官的成长发育，培育ES细胞的遗传性状的子孙。这是ES细胞的种系传递性[12]。 3几种家畜ES细胞的研究进展 3.1牛ES细胞的研究进展 牛ES细胞的研究已经进行了近30年[13]，很多研究人员在制作牛ES细胞系统上都做了很多努力和尝试，但是一部分牛ES细胞系统（表1）的形态和多功能性标记的表现有很大的不同，所以还没有找到合适的培养条件。因此，稳定的牛ES细胞系统依然没有确立[14]。 表1 部分牛类ES细胞系Table 1 Part of established bovine embryonic stem cell-like cell lines 作者与年代 Author and time 培养条件 Culture conditions 多能性基因 Pluripotent genes 克隆形态 Morphology 表面抗原 Surface antigen S.Saito,et al.2003 hLIF+hEGF+feeder(mSTO) POU5F1 紧凑型小细胞克隆et al.2005 LIF+FGF+feeder(MEF) POU5F1 圆顶形 Dome-shaped SSEA-4 M.Munoz,et al .2008 bFGF+feeder(BEF) NANOG _____ SSEA-4 gp96 C.G.Gong,et al.2010 LIF+FGF+feeder POU5F1 NANOG 圆顶形 Dome-shaped SSEA-1 M.L.Lim,et al.2011 LIF+FGF+EGF+feeder POU5F1 扁平 Flat SSEA-1 SSEA-4 E.Y.Kim,et al.2012 bFGF+feeder POU5F1 NANOG 圆顶形 Dome-shaped SSEA-1 TRA-1-81 V.Verma,et al.2013 2i/LIF+feeder POU5F1,NANOG KLF4,SOX2 扁平 Flat SSEA-3,SSEA-4,TRA-1-60/-81 T.Furusawa,et al.2013 2i/LIF+feeder POU5F1,NANOG SOX2 圆顶形 Dome-shaped SSEA-1,SSEA-4 但经过这么多年的研究，牛ES细胞系的建立也并非毫无进展，通过研究人员的不懈努力，使用糖原合成酶激酶3β(GSK3β)抑制剂CHIR99021和促分裂原活化蛋白激酶抑制剂 (PD032591、PD184352)来建立牛ES细胞系取得了显著的进展。M.Ozawa等[15]将CHIR99021和PD032591添加到发育6-8天的囊胚培养液中,NANOG和SOX2的表达量在囊胚中升高,在添加了这2种抑制剂的培养液中分离出来的ICM，形成的克隆簇最大可以传至19代, AP染色呈阳性 (对照组最多2代) , 特定条件下，在体外可形成拟胚体。T.Furusawa等[16]将CHIR99021和PD184352添加至7-8天的IVF和SCNT囊胚的培养液中，分别得到5个牛类ES细胞系, 呈现圆顶状克隆，AP染色呈阳性;表达多能性干细胞标记 (OCT4、SOX2和SSEA-1）；体外能够传代10-15次;根据体外分化研究，分化后的ES细胞的内胚层和外胚层的标记基因虽然上升了，但是中胚层的标记基因没有变化。在嵌合囊胚移植后，对D62胎儿进行了分析，发现牛类ES细胞参与了多个脏器的形成。因此，使用细胞信号路径抑制剂，调节牛ICM中的多能性细胞通道，为牛ES细胞的研究提供了新的构想。 3.2猪ES细胞的研究进展 至今猪ES细胞的研究依旧集中在分离和传代方法的优化上,但与牛的ES细胞一样，目前还没有发现能够分离猪ES细胞并维持ES细胞特性的可靠方法。这几年猪虽然有很多关于ES细胞系的报道，但是仍然没有得到具备嵌合能力的细胞系。另外，猪的特异性和可靠的方法也没有，完全证明是ES细胞系。因为猪ES细胞传输代数少，分离纯化难，容易分化，维持ES细胞的细胞特性相当难。这也是猪ES细胞建设系统成功率低的主要原因。猪的ES细胞和鼠标ES细胞有很大的不同。干细胞分子用鼠标标记可以很好地表现出来。因为猪不能表现出来，所以猪有可能存在特异的干细胞分子标志。猪ES细胞对磷酸缓冲液、胰蛋白酶等试剂的刺激敏感，在曝光数秒内就会引起分裂[17]。因此，猪ES细胞的分离和世代交替的方法与传统的方法不同。另外，白血病抑制因子（LIF）、干细胞因子（SCF）等细胞因子在小白鼠的干细胞培养中被成功利用，但是猪ES细胞的特性维持是否有效还需要进一步讨论。 放眼国内，关于猪的ES细胞分离和克隆的研究也比较少。其中引人注目的成果是，钱永胜等研究人员将分离出的猪类ES细胞分为两代[25]。冯秀亮等人的研究人员将猪类ES细胞继承到了5代，同时对分离的细胞进行了初步的检查和鉴定[26]。2009年，中国科学院上海生物化学和细胞生物学研究所的科学家将猪的细胞诱导变为多干细胞，首次实现了使用有蹄类动物的体细胞的结果[27]。 3.3羊ES细胞的研究进展 1987年, Handyside等从7-8日龄绵羊囊胚中利用绵羊成纤维细胞滋养层分离出了ES细胞, 得到了内胚层样细胞[18]。1991年, Notarianni等分离克隆了绵羊的ES细胞[19]。Modinski等利用分离得到的绵羊类ES细胞得到了2只嵌合体绵羊[20]。Campbell等得到了4只利用分离到1-3代的ES细胞作核供体进行核移植的绵羊[21]。Tsuchiya运用免疫外科手术的方法在STO滋养层上分离获得了8-9日龄的羊囊胚ICM培养以及传至4代的类ES细胞系[22]。在国内,近些年对山羊ES细胞的研究，孙国杰等通过利用山羊胎儿的成纤维细胞滋养层来培养山羊囊胚,并成功分离出了ES细胞, 且在传代实验中最高传至5代[23]。杨继建等分离培养山羊类ESCs最高传至8代，并得出能够使ES细胞稳定传代的连续多次消化法[24]。 4 ES细胞的应用前景 4.1克隆动物 自1996年7月5日，第1只克隆羊“多莉”出生, ES细胞在克隆动物方向的研究也正式扬帆，大型家畜的生殖周期长、产仔少,一直是良种培育的主要困难，而近些年核移植技术日益完善，为ES细胞在动物克隆方向上的广泛利用提供了良好的途径。使用优良品种的家畜胚胎进行分离克隆ES细胞，进行核移植的话，良种的家畜可以在短期内产生大量的遗传同质型的子孙。这不仅充分发挥了优良品种牲畜的生产潜力，而且迅速扩大了优良品种牲畜的集体规模，有力地促进了牲畜的培养工作进程。ES细胞克隆动物也可以用于拯救濒临灭绝的动物和保护罕见的野生动物。 4.2转基因动物 向ES细胞导入外源性基因，将ES细胞作为载体导入生殖系，从而生产转基因动物，这种方法是现在哺乳动物遗传工程的主要方法。ES细胞能够有效地进行从外部导入遗传因子、去除遗传因子、重组遗传因子等转基因操作，将外源的DNA随机或定向整合到基因组中并进行插入操作。经过筛选可得到阳性细胞，将阳性细胞注入囊胚腔，或者与其他胚胎结合，便可得到嵌合体子代。Stewart等将老鼠和8～16d的细胞胚胎聚合物配合，从而形成了嵌合胚胎，并将嵌合胚胎移植到受体鼠体内而得到了ESCs嵌合动物[28]。Stephen等将小鼠胚胎与恶化的小鼠ESCs进行共同培养，从而得到了转基因嵌合体，使生产的鼠胚胎的嵌合率达到90%以上[29]。用ESCs生产转基因动物，打破物种界限，加速了动物基因变异的程度。除此之外，可以在细胞水平上，进行胚胎的早期选择，提高选择的精度，缩短育种时间。 4.3性别控制 性别控制是指通过人介入干预雌性家畜所繁殖子孙的性别的繁殖技术。通过性别控制，受性别限制的生产性状和性别影响的生产性状可以获得更大的经济效益。研究结果表明，多功能干细胞可以在体外诱导，分化成包括生殖细胞的各种细胞类型。因此，将多功能干细胞在体外诱导并分化为，根据X和YDNA的含量用流式细胞仪分离，如果将分离出的体外受精，就可以控制家畜的性别。 5小结 综上所述, ES细胞的研究在家畜育种繁殖方面都已经取得了十分丰硕的成功,但，就总体来说，ES细胞的研究还处于初步阶段，相信未来，随着ES

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