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干细胞研究进展及其应用探讨
摘要：分析了干细胞研究现状、前景、科学意义、生物医学价值和伦理问题,阐述了近年来干细胞研究进展以及干细胞的应用情况。
作者简介：李敏（1990—），女，内蒙古乌拉察布人，内蒙古呼大学生命科学学院学生。中图分类号：R730.2文献标识码：A文章编号：16749944(2012)05029704
干细胞（stem cell）是机体内存在的一类特殊细胞,具有自我更新及多向分化潜能［1］。干细胞根据发生来源可分为胚胎干细胞和成体干细胞两类干细胞研究进展及其应用探讨。胚胎干细胞（embryonic stem cell,ES细胞）是由胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外培养而筛选出的细胞,具有发育全能性,理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞。成体干细胞是存在于已经分化组织中的未分化细胞,能够自我更新并特化形成该类型组织的多能细胞［2］。
胚胎干细胞是从动物早期发育的原始未分化细胞团（Inner Cell Mass,ICM）或原始生殖细胞(Primordial Germ Cell,PGC)分离得到的一种未分化的永久性细胞系［3］。ES 细胞具有具有以下特性：①ES 细胞具有自我更新的能力：可以通过自我更新来维持其干性；②ES 细胞具有发育的全能性：任何一个ES 细胞都具有发育成一个完整个体的潜能。在体外,ES 细胞可诱导分化出包括三个胚层在内的所有分化细胞,若将ES 细胞注射到严重联合性免疫缺陷（SCID）小鼠或同源动物体内,可产生出三个胚层组织构成的畸胎瘤；③ES细胞具有生殖系嵌入特性,具有种系传递功能,能与另一个正常胚胎嵌合,获得包括生殖系在内的动物个体。而且在体外对ES 细胞进行遗传操作选择,通常不会改变选择后的ES 细胞本身的遗传性能。即理论上经遗传操作后的ES细胞仍能保持其扩增、发育的全能性。全能性是ES 细胞具有可塑性的基础,也是ES细胞优于成体干细胞的地方［4］。
成体干细胞（Adult Stem Cell）是指存在于成体已分化组织中的未分化细胞,这种细胞具有自我更新和多向分化的潜能,在特定的培养条件下可以形成组成该类型组织的多能干细胞的统称。成体干细胞的来源不仅包括成年的动物,还包括未成年动物组织干细胞。成体干细胞具有以下特性：①成体干细胞具有自我更新的能力：可以通过自我更新来维持其干性；②成体干细胞具有多向分化的潜能：成体干细胞不具有ES细胞的全能性,但是具有多能性,即成体干细胞在自然条件下倾向于分化成所在组织的各种细胞,用于维持机体新陈代谢。但是,在特定外界条件诱导下,一种组织的成体干细胞可以“横向分化”成其他组织的功能细胞,参与组织的损伤修复。
目前为止发现的成体干细胞主要包括造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、肌肉卫星细胞、皮肤表皮干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞、 头发毛囊干细胞、 胰腺干细胞等。
干细胞的研究是从血液系统开始的。1990 年诺贝尔医学和生理学奖得主Gunnar Thomas等人在1967年将正常人的骨髓移植到病人体内,可以治疗造血功能障碍,从而开始了干细胞应用于血液系统疾病的临床治疗。2007年诺贝尔医学和生理学奖得主Martin Evans 等在1981年从小鼠囊胚中分离出胚胎干细胞。20 世纪70 年代末,中国科学院上海细胞所开始小鼠胚胎细胞及其诱导分化的研究,并于1987 年建立了我国第一株小鼠ES 细胞系［5］,并用生长因子的基因操作成功地诱导ES 细胞分化为血管内皮细胞［6］。1998年,美国的Thomson 和Shamblott 两个研究小组又成功地使人类ES细胞在体外生长和增殖［7］,使科学家们看到了干细胞生物工程的曙光：用体外培育的组织细胞取代病人体内坏损的组织细胞。1999 年,美国科学家Goodell 发现小鼠肌肉组织干细胞可以横向分化成血细胞。随后,世界各国相继证实成体干细胞,包括人类的干细胞具有可塑性,这为干细胞的临床应用开辟了更为广阔的空间。此外,2007年美日两个研究小组几乎同时宣布成功地将人体皮肤细胞改造成了几乎可以和胚胎干细胞相媲美的干细胞——“iPS细胞”,即诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPS细胞)。iPS细胞的诞生为国际干细胞研究带来了新的研究思路和方向,其应用前景更加的广阔。
由于ES 细胞具有自我更新和全能性,即ES细胞能制造机体需要的全部细胞的同时还维持着其自身的干性,使得ES细胞在医学和生物学上具有巨大潜力以及应用前景。但是,由于ES细胞移植后可能会带来免疫排斥反应,且培养获得需破坏胚胎,其应用就受到伦理学限制。
成体干细胞,由于其存在于宿主体内,可从患者自身获得。此外,有些细胞,如MSC具有低免疫原性,故移植后不存在免疫排斥反应的限制也没有伦理学方面的困扰。使得科学家们逐渐将研究目标转向成体干细胞,将这种类型的干细胞作为组织工程的终点研究对象。但是,成体干细胞只能在体外有限扩增,多系分化效力低,通过体外的扩增培养虽能够提高转化效率。然而体外转化是否会引起干细胞遗传特性的改变尚不清楚。因此,胚胎干细胞和成体干细胞的研究对生命科学领域而言,都具有极重要的意义,其研究成果将能互为裨益、相得益彰［8］。
利用ES细胞作为载体,体外定向改造ES细胞,使基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平进行,从而获得稳定、满意的转基因ES细胞系,以生产转基因动物。
用ES细胞为细胞核的供体进行核移植后,在短期内可获得大量基因型和表型完全相同的个体。此法明显优于体细胞克隆动物,但后者克隆动物的成功率较低,易出现严重的免疫功能缺陷和突变( 法国农业研究院称90% 克隆牛不能正常生长)。老鼠的胚胎干细胞中能产生出精、卵细胞,并能成功受精甚至可以从雌性和雄性细胞中培育出实验室卵细胞,将促进生殖和克隆的研究。
哺乳动物早期胚胎的体积很小,又在子宫内发育,要想在体内研究细胞分化及其机理几乎是不可能的,而干细胞特别是ES 细胞具有独特的发育全能性,在特定的体外培养条件和诱导剂的共同作用下经过若干前体细胞阶段,可分化为神经、肌肉、软骨、血细胞、上皮细胞和成纤维细胞等,因此ES细胞是研究特定类型细胞分化的模型、探索某些前体细胞起源和细胞谱系演变的较为理想的实验体系。应用基因芯片等生物技术,比较ES 细胞不同发育阶段细胞的基因转录和表达,不仅可确定胚胎发育及细胞分化的分子机制,还可发现新的基因。借助基因打靶技术,通过囊胚注射制作嵌合体的途径,将外源基因引入受体基因库,可在整体水平上研究高等动物的基因表达、调控和生理功能,同时也会为阐明胚胎发育中基因表达的时空关系提供手段。
ES细胞提供了新药的药理、毒理及药物代谢等细胞水平的研究手段,既减少了药物实验所需的动物数量,又便于找到有效和持久的治疗方法。无论采取自体或异体移植来修复缺损组织和器官,都受到客观条件的限制,特别是种子细胞的来源不足。现在,干细胞工程学的诞生和发展,使组织和器官的移植研究进入了新的阶段,有望解决上述问题。据报道,小鼠ES细胞在特殊条件下分化为骨母细胞,结合组织工程技术,形成有可能被用于骨修复的骨组织［9］由于尚有一些复杂的问题有待解决,因此目前着重于从成年或幼年器官或组织的碎片中分离、培养和扩增某一类型的组织干细胞［10］。ES 细胞作为移植源细胞和基因治疗源细胞,通过定向分化取代受损的细胞,其免疫排斥反应不大。现已证明,源于ES细胞的细胞已能或可能治疗许多相关疾病,如心肌细胞治疗心脏疾病,白细胞治疗白血病,胰岛细胞治疗糖尿病,肝细胞治疗肝炎,软骨细胞治疗骨关节炎,皮肤细胞治疗烧伤和创伤,骨细胞治疗骨质疏松症,神经细胞治疗帕金森氏症等。
HSC是体内各种血细胞的唯一来源,成体内的HSC主要存在于骨髓中,外周血中也有［11］。目前,HSC已广泛用于白血病的治疗,有数据显示国际上应用HSC移植联合化疗治疗急性淋巴细胞白血病的5年无病生存率约为80%,个别治疗中心可达90%,而急性非淋巴白血病也可达40%左右［12］。此外,对放、化疗敏感的晚期癌症患者或常规治疗无效、复发或高度恶性的癌症患者,可先用超大剂量的放、化疗最大限度的清除患者体内的癌细胞,然后移植HSC重建被破坏的造血系统和免疫系统［11］,这种联合治疗已经成功应用于乳腺癌、神经母细胞瘤等恶性疾病的治疗［13］。HSC还应用于慢性肝炎等一系列疾病的治疗中。
应用HSC对许多疾病的治疗应经进入了临床试验阶段,在我们最近发表的一篇文章中［14］,用计算机检索了截止到2011年1月31日,中国临床试验注册中心数据库及美国clinicaltrials数据库中注册的干细胞用于乳腺癌治疗的临床试验研究。在中国临床试验注册中心数据库中输入检索词为“乳腺癌”,共检索到23例,其中符合标准的仅有1例。在美国clinicaltrials数据库中输入检索词为“stem cell + therapy + cancer”,共检索到2551例,其中用干细胞治疗乳腺癌的临床试验共134例,包括I期临床试验的73例,II期52例,III期9例。134例临床试验中使用的干细胞均为HSC,未见其它类型的干细胞,所用HSC的来源包括骨髓、外周血和脐血。
MSC是一类来源于中胚层的、具有自我更新及多向分化潜能的干细胞,在体外能够分化为多种细胞,如骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等［6］。与HSC的研究相比,MSC的研究起步较晚,但发展很快。研究发现MSC可以定向归巢到病变组织并在病变组织中存活和增殖。在体外对MSC进行基因修饰后注入体内,能够归巢到病变组织而杀死病变组织的细胞,这一特点使MSC成为了细胞治疗的极好的载体 ［15,16］。
除此,MSC对难治性移植物抗宿主病（Graft Versus Host Disease,GVHD）具有很大应用价值,MSC具有免疫调节作用,能抑制GVHD［17］；MSC可用于自身免疫疾病的治疗,MSC分化的软骨细胞具有与MSC共同的特性,MSC可以通过表达成骨及血管生成因子协同促进修复骨缺损［18］；MSC还可以减轻炎症反应,将转染睫状神经营养因子基因的MSC用于过敏性脑脊髓炎模型鼠后,外周血肿瘤坏死因子-a表达水平明显降低,损伤部位炎性细胞浸润减少,显示出良好的治疗效果［19］。由于骨髓源性的MSC能够阻止肝纤维化进展,使得MSC可以应用于治疗肝硬化［20］。MSC可以使新血管生成增加、心肌再生,因此异体人MSC可以应用于急性心肌梗死等心脑血管疾病［21］。MSC移植可使神经细胞再生和神经结构重建,恢复损伤的神经功能,使其成为治疗神经系统疾病理想的种子细胞。化疗后病人骨髓MSC增殖能力、粘附性及分泌白介素及干细胞生长因子的能力均下降,因此MSC对于辅助化疗的病人具有潜在临床应用价值［22］。除以上应用外,MSC在支持造血干细胞体外扩增及治疗面部皱纹等方面亦取得一定效果［23］,MSC治疗糖尿病、肾病［24］等疾病的研究正在进行中。还可治疗克罗恩病、成骨不全、软骨损伤、脊髓损伤［25］等疾病。
神经干细胞及精原干细胞由于其发生部位限制了其广泛应用,但其用于治疗特定部位引起的组织特异性疾病功效十分显著,神经干细胞也用于治疗脑梗塞、帕金森等神经系统及脑组织病变引发的疾病。精原干细胞主要用于男性不育方面。
iPS细胞是通过导入几个与多潜能性相关的因子至体细胞中而获得的多能干细胞,它具有与胚胎干细胞相似的特点,可以分化为HSC,也可以作为基因运载细胞,同时由于可以培养来自于患者自体细胞的iPS细胞,使用时不存在免疫排斥问题［26~28］。当前,研究者已经获得了无病毒基因组成分的iPS 细胞,去除了可能因病毒随机插入而导致的安全隐患［29,30］。因此,尽管目前还没有iPS细胞用于疾病治疗的研究,推测iPS细胞也有望应用于临床治疗相关疾病,并且其可能具有与胚胎干细胞一致的相关功能,因此有望得到广泛应用。
由于干细胞具有如此之多的优势,其发展前景十分广阔,在临床应用上也具有不可估量的潜力,因此全面的对干细胞进行系统的研究很有必要。目前仍存在一些问题急需解决,如人胚胎干细胞和胚胎生殖细胞体外培养时增生而不分化的机制是什么？抑制干细胞分化的内源性机制是什么？成人干细胞在体内有无可塑性,可塑性是否所有成人干细胞都发生,调控因素是什么？驱使干细胞到损伤部位修复损伤的因素是什么？干细胞分化成特定细胞和组织作为的依据和机制是什么？干细胞分化的哪个时期最适合移植需要,最适合药物或毒物的筛选,具有最强的携带治疗药物的能力,移植后在体内的成瘤性等。弄清这些问题的答案是进行临床应用的基础。
［2］ 赵春华.干细胞原理、技术与临床 ［M］.北京：化学化工出版社,2006.
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