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　　1、进展述评 医学与哲学(临床决策论坛版)2010年11月第31卷第11期总第417期 肿瘤干细胞分离方法研究现状 李英华 张 弦 张 斌 刘 关 周 欢 刘 丹 张 阳 摘要：肿瘤干细胞理论能够解释肿瘤的发生、发展和转移等生物学行为，使人们对恶性肿瘤有一个全新的认识，为临床治 疗展现全新视角，使肿瘤靶向治疗找到了新靶点，改变目前药物针对全部癌细胞的治疗策略。本文就肿瘤干细胞分离方 法做一简要综述。 关键词：肿瘤干细胞，肿瘤干细胞分离，分选仪器，分选原理，生物学特性 中图分类号：R73o 文献标识码：A 文章编号：1002 0772(2010)11 004403 The Current Statu

　　4、e separation of CSC Key Words：CSC，separation of CSC，separation apparatus，separation principle，biological property 关于癌症发生、发展有多种学说，如多因素、多阶段学说和 克隆选择学说等，其理论尚不完善，难以应用于临床。传统癌症 治疗是通过手术、放疗、化疗等方法，消灭大部分癌细胞，但临床 常需面对治疗后复发、转移和耐药等严峻问题。肿瘤干细胞 (cancer stem cells，CSC)理论认为CSC在肿瘤形成、生长、浸润、 复发和转移中起重要作用，杀死CSC能最终治愈肿瘤，使人们对

　　5、恶性肿瘤有了一个全新的认识，为临床治疗展现全新视角，肿瘤 靶向治疗找到新靶点，使治愈肿瘤成为可能。 1 CSC概念的形成 肿瘤发生的原因普遍认为是内在遗传物质与外在环境相互 作用，导致突变事件累积，产生肿瘤。早期研究形成肿瘤生长随 机假说，认为肿瘤细胞是均质的，进入细胞分化周期的肿瘤细胞 很少，是一个小概率随机事件。 但随后大量研究发现这一结论与实际观察结果不符，产生 层级假说。该学说认为只有有限数目的肿瘤细胞具有产生肿瘤 的能力，这些细胞再生肿瘤是高频事件，并引起肿瘤异质性。2O 世纪5O年代有人做过肿瘤移植的人体实验，即将35例患者约 1o亿个自身的肿瘤细胞分别注射到各自的大腿和前臂，只有

　　6、7 例自体移植物在注射部位长出肿瘤。1958年，Hewitt1j把小鼠 白血病细胞移植到同品系的小鼠体内，发现移植细胞只有1 4 能够形成脾脏内克隆；1977年 在人肺癌、卵巢癌、神经母细 胞瘤的体外培养实验中发现仅有11 000到15 000的肿瘤细 胞能在软琼脂上形成克隆。因此推测肿瘤并不是由均一的肿瘤 细胞构成，只有其中一小部分细胞具有肿瘤再生能力。 这两种假说都肯定了肿瘤组织中细胞生长的不均一现象， 但对这些起始细胞的特性及生物学行为缺乏令人满意的解释， 大连医科大学附属第二医院肿瘤内科 辽宁大连 116023 大连医科大学研究生院 辽宁大连 116044 究竟是何种细胞行使肿瘤起源细

　　7、胞的功能?Mackillop 3 于1983 年最先提出CSC假说，他认为肿瘤来源于某些积累了一系列突 变事件的干细胞。1997年Bonnet4 第一次在急性髓性白血病 (AML)患者体内分离出表面抗原标记为CD。 CD s。的细胞， 占AML总细胞数量的02 ，将这部分细胞移植到非肥胖型糖 尿病重症联合免疫缺陷小鼠(NODSCID)后会引起AML的发 生，而将其他的AML细胞以更大数量移植到NODSCID小鼠 体内却不能引起AML的发生。提示这部分拥有CD。 CD。 表面标记的细胞可能是CSC。随后研究人员使用类似的实验方 法，在乳腺癌、肺癌、结肠癌等实体瘤中也鉴定出CSC的存在。 曾经认为

　　8、CSC是肿瘤组织中的一小群具有广泛繁殖能力并组成 肿瘤的细胞。AlHajj则认为机体中具有无限自我更新潜能。 将其移植至免疫缺陷鼠体内，能高效地产生异质性肿瘤的肿瘤 细胞为CSC。Clark又将CSC定义为肿瘤组织中能构成细胞自 我维持的细胞集合群，并有独特的自我更新能力及产生异质性 的细胞群体，从而构成肿瘤的肿瘤细胞。美国癌症联合会2006 年按功能将CSC定义为肿瘤中具有自我更新能力并能产生异质 性肿瘤细胞的细胞。 2 CSC的分离 21根据分选仪器不同分为荧光活化细胞分选术(FACS)和磁 性活化细胞分选术(MACS) FACS是较常用的分离肿瘤干细胞的方法，它能够一次性进 行多标志分选

　　9、，而且能够选择荧光强度大的肿瘤细胞，分选纯度 高，特异性强，但需要具备有分选功能的流式细胞仪，并且无菌 操作过程相对繁琐。MACS是利用未标记的抗原等蛋白的单克 隆抗体作为第一抗体与单细胞悬液孵育后，再与免疫磁珠标记 的第二抗体结合，这种特异性标记的细胞悬液流过特制的永久 磁铁的磁场时，被吸附在磁式分选柱内，再将磁式分选柱移开磁 场从柱内洗脱，从而分离干细胞。MACS需要的设备简单，能够 Medicine and Philosophy(Olinical Decision Making Forum Edition】，Nov 2010。Vol 31，No 11，Total No 417 肿瘤干细胞

　　10、分离方法研究现状李英华等 在超净台中操作，但进行多标志分选时需要分步进行。这两种 分离技术均有赖于CSC表面标记物的识别。 22根据分选原理不同分为表型标记筛选法和侧群细胞(SP) 筛选法 221方法分类：(1)表型标记筛选法：用荧光标记的表型标记 抗体温育细胞，抗体结合到表型标记后，在流式细胞仪荧光活化 系统检测下将标有荧光的细胞分选出来。肿瘤细胞至少具备两 种表面标记，一种是成体干细胞或祖细胞的同源或异源表面标 记；另一种是以前被广泛报道的与多种肿瘤发生、发展、转移和 复发密切相关的细胞表面标记。该方法特异性强，而且能够根 据细胞表面标志分子将肿瘤细胞分为多种不同的亚群进行分 析。(2)S

　　11、P法：Goodell等进行造血祖细胞分析时，发现有一群 细胞在流式二维分析点阵图上呈彗星状，分布在干 祖细胞主群 的一侧，故称为侧群细胞。该方法中用结合DNA的荧光染料 (如Hoechst 33342、Rhodaminel23)处理细胞，用维拉帕米阻断 钙离子依赖转运泵(ABC转运蛋白家族)作为对照组，利用肿瘤 干细胞可将染料泵出细胞的性质，经过荧光活化细胞分选系统 的分析，将不被染色或低染色的CSC筛选出来。应用该法研究 头颈部CSC发现SP细胞高表达干细胞表面标记l5 。在荧光显 微镜下观察SP细胞比流式细胞仪分析更直观，很适合没有明显 细胞表面标志的CSC的分选，但存在非特异性。SP细胞

　　12、代表的 干细胞学说面临挑战，Burkert等 证实在7种胃肠癌细胞株中 存在SP细胞，选择其中的4种癌细胞株进行干细胞生物学行为 鉴定，发现分离的SP表型细胞群和非SP表型细胞群在体外克 隆形成和体内致瘤能力上无明显差别。 222分子基础：(1)表面标记有两类：一种是正常干细胞 祖 细胞的标记：CSC学说认为CSC可能源于正常干细胞的累积突 变和或祖细胞通过基因突变重新获得自我更新能力，CSC可能 带有同源正常干细胞祖细胞的表面标记。如CD133是一种5 一跨膜糖蛋白，存在于正常和初级造血、神经、内皮和上皮系癌 细胞膜上的抗原，其显著特点就是随着细胞的分化表达迅速下 调，是一个独特的分离和鉴定

　　13、干细胞和祖细胞的分子标志。目 前已经从多种脑肿瘤中分离出肿瘤源性细胞，包括星形细胞瘤、 恶性成神经管细胞瘤及胶质母细胞瘤，这种脑肿瘤源性细胞与 正常神经干细胞有相同的标记CD 。研究发现肺癌干细胞存 在与支气管肺泡干细胞相似的表面标志物，如Sca1+， CD 一，Pecam ，CD。 等。Nanog是全能性和多能性干细胞标 志物，其在分化的组织中均表达降低或消失。Ben7 在乳腺癌、 膀胱癌等肿瘤中发现有Nanog的表达，肿瘤级别越高，表达越 强，Nanog表达与肿瘤分化状态相关。AMI 及CML中的肿瘤 干细胞具有与造血干细胞相同的标记CD。 一CD。 。另一类 CSC标记可能是与肿瘤的发展

　　14、、转移有关的标记，如CD 属粘附 分子家族中的一员，是细胞外基质透明质酸的受体，是分布极为 广泛的细胞表面跨膜糖蛋白，主要参与细胞与间质之间特异性 粘连过程。Fillmore等 发现，在乳腺细胞中，已分化细胞主要 表达CD ，而祖细胞群样的细胞则更多表达CD ，并且以 CD CD： low为表型的乳腺细胞表达的基因主要与细胞的 能动性及血管生成有关，它们是更为间质的、能动的和雌激素受 体阴性的细胞，并且与问质型乳腺癌密切相关。(2)功能性标 记：ALDH是分选侧群细胞的主要标记。ALDH+细胞在体外 克隆形成能力是ALDH一细胞的三倍以上。Jiang等 将AI 一 DH用在肺肿瘤干细胞的分选中

　　15、，并证明ALDH+细胞具有自 医学与哲学(临床决策论坛版)2010年11月第31卷第11期总第41 7期 我更新及多向分化潜能。ABCG2蛋白是耐药基因ABC转运蛋 白家族成员ABCG2Bcrpl基因产物，ABCG2蛋白表达与sP细 胞表征密切相关，推测它除了排出对干细胞有害的毒物，还能排 出分化诱导因子，维持干细胞的未分化状态。因此，ABCG2被 认为是干细胞的通用标志物，是从不同组织中分选多潜能干细 胞的新途径。费城杰弗森科摩癌症研究中心的研究人员“ 对 11号基因组的某个信号片段的功能有了突破性的发现。SAGA 是一个至少由2O个蛋白组成的不依赖ATP的多功能染色质重 塑复合物，它通过对

　　16、组蛋白H3和H2B氨基末端赖氨酸乙酰化 修饰来松动染色质结构，从而促进基因转录的起始。他们确认 了USP22作为h SAGA复合物的一部分，在多种肿瘤中有高表 达。USP22号基因编码了一种与癌症有关的、能控制基因表达 大幅度变化的酶，这一组基因被称为“癌症干细胞的信号”。 CSC特异性标记已被应用于CSC的分离，但细胞特异性标 记的表达与CSC的自我更新和分化特征之问的联系尚不明确， 因此特异性标记不能单独用于CSC的分离；分离CSC的标记物 分子并不是高度特异的，一种组织CSC标记物不能用于其他组 织CSC标记，对CSC特异性标记物有待于进一步深入研究。 23根据干细胞生物学特性分为悬浮培

　　17、养和上皮一间质转化 (EMT)等方法 (1)悬浮培养法：该法首先是在神经干细胞的研究中被采用 的。未分化、具有多向分化潜能的神经干细胞具有悬浮生长并 形成神经球的特性，而且，此种方法培养的细胞能够保持多向分 化的潜能，其干细胞比例可达到4 2o 。借鉴神经干细胞的 培养技术，将新鲜的乳腺上皮标本分离成单细胞后，在无血清培 养液中进行悬浮培养形成小的细胞团，将其分离后再次进行悬 浮培养，仍可得到乳腺微球，经流式细胞仪分选，微球中具有乳 腺干细胞标志的细胞比率远远多于正常乳腺上皮 。 (2)EMT法：上皮间质转化上皮细胞与其周围间质的相 互作用过程中逐渐获得间质细胞特性，表现为上皮细胞在形态 学上

　　18、发生向成纤维细胞或间充质细胞表型的转变并获得迁移的 能力。应用该方法可体外检测肿瘤细胞的迁移、侵袭能力。乳 腺癌转移时，癌细胞极性丧失，发生EMT。Gupta等 通过sh RNA抑制CDH1基因(编码Ecadherin)导致EMT，获得CD hCD。 l细胞是对照组1O倍以上；形成乳腺微球体能力是对照 组100倍。表明通过EMT能够富集乳腺癌干细胞。 (3)利用多药耐药性富集CSC：CSC与正常干细胞具有许 多相似的特征，大多处于细胞周期的GO期，表达特异性的ATP 结合盒，如ABCB1、ABCG2等介导的膜泵耐药分子，使其对放 疗、化疗天然耐药。根据CSC生物学特性中固有的对放、化疗的 耐受

　　19、能力以及临床试验发现，在经过化疗后的乳腺癌患者的病 灶中CD CD low的细胞比率增加；而针对表皮生长因子 受体的酪氨酸激酶抑制剂拉帕替尼靶向治疗不会导致患者治疗 后循环血中CD CDe low细胞数量增多1。提示传统的 细胞毒性药物可以作为富集肿瘤干细胞的方法。 实体瘤CSC的分离纯化困难，首先考虑在肿瘤组织制成单 细胞悬液的过程中，蛋白水解酶对细胞表面抗原的破坏等原因， 单细胞悬液细胞活力受到影响；其次许多实体肿瘤的CSC标志 蛋白不具有通用性；实体瘤CSC比率低；还有大多数流式细胞技 术使用高压力下d,TL径流，不适用于体积大、质地脆的许多实体 瘤的分离；实体瘤组织正常干细胞干扰等。

　　20、3肿瘤干细胞研究展望 Medicine and Philosophy(Clinical Decision Making Forum Edition)，Nov 2010。Vol 31。No 1 1Total No 41 7 肿瘤干细胞分离方法研究现状李英华等 医学与哲学(临床决策论坛版)2010年l1月第31卷第11期总第417期 目前血液系统CSC已得到确认，应用相似的研究方法对实 体瘤中是否存在CSC还停留在进一步验证和分离阶段，对CSC 的确认，还有待于对肿瘤生物学特性的充分认识和生物学技术 的进一步发展和完善。未来的工作重点定位在CSC基因表达谱 和相关信号传导通路的研究、标志分子的筛选

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