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　　理想情况下，一种真正的干细胞系在体外处理前，必须在体内环境下来鉴别出来。但是，目前大多数分离干细胞的工作都是在体外模拟环境中进行的。 体外分离技术是建立在对细胞表面标记物的识别基础上。已经用来纯化干细胞的标记包括 CD34、AC133、STRO-1、神经营养受体p7520等。分离方法包括荧光标记细胞分选、免疫磁珠分离和免疫吸附柱分离。

　　最近发现了一些新奇的细胞标记物阴性的干细胞，因此有些人对使用单一细胞标记物来分离干细胞提出了一些异议。例如，细胞膜上的CD34表达并不总是与干细胞的活动有关。在小鼠身上有大量静止的干细胞系，它们缺乏CD34的表达，但是却拥有完全的再建能力。一种类似的静止CD34阴性的造血干细胞 也在人体上被发现。因此，利用某些特定成熟细胞的表面标记物，来去除成熟细胞而保留干细胞的方法，将会在未来占据更大的优势。

　　鉴别和分离干细胞的一些常用标志：当干细胞更适合作为一种功能学上的概念时，一些分子标志物已经被用来给不同的干细胞群体定性。尽管这些早期标志物的作用还有待确定，细胞独特的随发展阶段而变化的表面标志，为初步鉴定并分离干细胞提供了有用的工具。现总结以下标记物单独或联合应用于干细胞研究，以鉴别和分离细胞：

　　胚胎干细胞的分离目前胚胎干细胞来源主要是胚泡内细胞群和生殖嵴中的原始生殖细胞

　　胚胎干细胞的分离免疫磁珠法：分离细胞基于细胞表面抗原能与连接在磁珠上的特异性单抗相结合，在外磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与相连着磁珠的特异性单抗结合而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。

　　免疫磁珠法分正选法和负选法，也称阳性分选法和阴性分选法。正选法-磁珠结合的细胞就是所要分离获得的细胞；负选法-磁珠结合的细胞为不需要细胞。一般负选法分选较为常见，因为此方法获得的所需要的细胞表面不含有抗体及磁珠的干扰。

　　胚胎干细胞的分离免疫外科方法：该方法基本原理是利用囊胚腔对抗体的不通透性，通过抗体、补体结合对细胞的毒性杀伤作用，去除滋养层细胞，保留内细胞团（ICM）进行培养。

　　胚胎干细胞的分离组织培养：将4-6天的胚胎取出培养，滋养层在培养皿底部平铺生长，而内细胞团形成卵圆柱状结构，在显微镜下用玻璃针挑出这种柱状结构，消化传代。显微外科学法：利用显微镜直接将内细胞团从胚泡中吸出进行培养。

　　胚胎干细胞的培养选择最优化的细胞培养基对于ESC的研究及临床应用至关重要。一个合格的ESC培养基的首 要条件为促进ESC的永久性分裂增殖及维持ESC 的未分化状态，前者是对ESC数量上的要求，后者是对其功能的保证。

　　目前已建立有很多的标准方法，一般要求 ESC生长在有丝分裂失活的饲养层细胞 (FEEDER)上，基本培养基多为DMEM并添加胎牛血清 (FCS)及白血病抑制因子(LIF)等。另外，为了排除不明外源血清成分及病原体等干扰，在 满足促进ESC分裂增殖及维持其全能性的基础之上，又尝试建立了其他培养基，包括条件培养基 (CM)、无饲养层、无血清、血清替代物(SR)非条件培养基等。 使用较多的仍是饲养层细胞培养法。

　　成体干细胞的分离主要使用组织消化法，密度梯度离心法和联合分离法(组织消化+密度梯度离心)对相同取材的组织进行细胞分离。成体干细胞的培养主要使用贴壁培养法、密度梯度离心法和悬浮培养法培养。

　　肿瘤干细胞的分离目前国内外肿瘤干细胞一般的分离是，先制备成单细胞悬液，离心弃上清液后在无血清培养基上培养，为获得较好的培养效果，可以根据细胞的种类不同添加一种或几种生长因子。然后用流式细胞仪分选法或免疫磁珠分选法等，分选出具有肿瘤干细胞表型或生物学特性的细胞，即肿瘤干细胞。

　　流式细胞仪分选法：流式细胞仪分选法，也称为荧光活化细胞分选法，是利用待分选细胞结合荧光素标记抗体能力的差异，或者利用外排荧光染料性质的差异来分离肿瘤干细胞，有无荧光标记的细胞引发的光电讯号不同，故带上的电荷也不同。

　　免疫磁珠分选法：免疫磁珠法，又称磁性激活细胞分选法，基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过结合抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞不能与特异性单抗结合，故不能被磁珠捕获，因而没有磁性，不在磁场中停留，从而使细胞得以分离。相对于流式细胞仪分选法，该法成本较低，适合国内采用。

　　旁群细胞分选法：有研究表明体外培养的旁群细胞具有神经干细胞的特性，且与非旁群细胞不同，旁群可以在裸鼠中高效表达移植瘤。由于肿瘤干细胞胞膜高度表达ATP结合盒(ATP-binding cassette．ABC)膜转运蛋白 (包括P-糖蛋白P-gP、乳腺癌耐药蛋白、 ABCG2、ABCGl 等)，对进入细胞内的化疗药物和染料有外排泵作用。因此可以利用旁群细胞不被 Hoechst 33324和Rhodaminel23染色的特性，即利用干细胞通用分子标记Bcrpl／ABCG2来分离纯化肿瘤干细胞，这一方法有利于分离纯化未知表面标志物的肿瘤干细胞。

　　为克服干细胞数目少的局限性，研究人员致力于开发干细胞体外扩增技术。 目前科学家已成功开发体外培养人造血干细胞（HSC）技术以获得大量HSC。IL-3、干细胞因子（SCF）和Flt-3配体（FL）具有早期效应和细胞系非特异性造血刺激功能，因而在干细胞扩增中颇受青睐。

　　在加入FL、TPO(thrombopoietin) 、IL-6 和IL-11 条件下，脐血HSC得以最大程度地扩增。PDGF- BB和 EGF 则使人多能髓性造血干细胞（PMSC） 最大程度地扩增。神经元祖细胞已从人皮质培养物中成功分离，并在EGF和FGF-2条件下扩增，200天 不到的时间内细胞数增加了150万倍。 这些体外干细胞和祖细胞扩增实验的开展，归功于重组细胞因子和细胞筛选技术的进展。因此发现新细胞因子和已有细胞因子的新功能，可促进干细胞扩增的研究。另外，系统性分析生长因子受体的表达，有助于设计干细胞体外扩增培养的新方法。

　　干细胞在生命科学的各个领域都有着重要而深远的影响，如移植治疗、克隆动物及转基因动物的生产、细胞组织和器官的修复、组织工程等有着广阔的应用前景。

　　1、移植治疗移植治疗目前已成为治疗疾病的一个重要手段，如、细胞移植等。20世纪80年代起，造血干细胞移植已经用于治疗癌症、造血系统疾病、自身免疫系统疾病等。之后，外周血干细胞移植并辅以化疗及细胞因子（如 CG--CSF、GM--CSF ）等，可使更多的干细胞进入外周血。

　　1 9 8 9 年首例脐血治疗Fanconi,s 贫血成功后，许多国家纷纷建立了规模不等的脐血血库。因脐血富含造血干／祖细胞，其免疫细胞的抗原性较弱 ， CTL祖细胞较少，与移植相关的移植物抗宿主病（ GVHD ）的发生相对骨髓的外周血少而轻，采集容易，对供者无任何伤害，故被认为是极具潜力的新造血 干细胞的来源。

　　神经干细胞研究虽然起步较晚，但却是当前研究的热点。这与人类社会正在逐渐步入老龄化有关。一些老年性疾病如老年痴呆症、帕金森病、卒中等，一般都伴有脑或脊髓相应部位的特定神经元的死亡。目前用胚胎干细胞或神经祖细胞治疗这些疾病，在动物实验中已取得初步成效，将这些细胞植入到动物模型的相应部位，可观察到它们分化为有功能的神经元，还可改善因缺血引起的学习、记忆障碍，并且部分恢复动物的肢体功能。此外，神经干细胞移植还 可能用于脊髓损伤、脑外伤等的治疗。神经干细胞的临床价值已在人的帕金森病中得到证明。

　　除造血干细胞、神经干细胞外，用胚胎干细胞和其它类型干细胞来治疗疾病的实验也正在进行中。 值得注意的是：除造血干细胞外，其它干细胞的研究尚处于起步阶段，很多实验结果来自于动物模型，将这些来自动物模型的结果用于临床实践，还需要进一步的实验证据。

　　最近研究报道： 一位印度科学家和一家英国生物公司合作，利用病人自体血液样本培育出骨髓干细胞，成功地将生命垂危的血液病病人从死亡边缘拉了回来。如果这一个性化的干细胞疗法被证实有效，其贡献不亚于弗莱明发现青霉素。 他们将一种抗体CR3/43抗体（由丹麦 DakoCytomation公司生产）附着在MHCⅡ表皮细胞分子上（人体免疫细胞发生变异后， MHCⅡ表皮细胞分子会无限增殖，从而引发白血病），这些白血病细胞似乎进行了“逆分化”，形成了骨髓干细胞。其中有些新形成的骨髓干细胞又重新分化成为各种类型的血液细胞。

　　干细胞移植研究——适合治疗的疾病有：帕金森病，糖尿病，慢性心脏病，终末肾病，肝脏衰竭，癌症。

　　● 已掌握了脐血干细胞分离、纯化、冷冻保存以及复苏的一整套技术，并在上海建立我国第一个脐血干细胞库。

　　● 进行了人类胚胎神经干细胞体外培养和人类成体神经干细胞研究，完成了神经细胞储存 及复苏、应用研究，并用体外培养的神经干细胞移植到动物身上，使肢体瘫痪动物肌张力逐步恢复（河南医大报道，瘫痪的兔子也能爬行）。

　　（1）究竟哪种类型的细胞最适宜移植？ 研究表明，如果将胚胎干细胞植入免疫缺陷小鼠的皮下，将会形成畸胎瘤，因此很显然，未分化的胚胎干细胞并不适于移植，但究竟哪一阶段的祖细胞，或是成体干细胞适于移植，还有待研究。

　　（2）如何避免干细胞移植中的免疫排斥问题？ 目前可能的方法有三种：第一种是将体细胞核转 移到未受精的去核卵母细胞中，这种卵母细胞发生卵裂后形成胚泡，然后从中分离筛选得到胚胎性干细胞，这就是所谓的“治疗性克隆”。利用这种技术获得的ES细胞，由于其基因型与受体细胞完全一致，相当于自体移植，从而避免了免疫排斥反应；第二种是可以利用基因工程技术，将干细胞表面的MHC基因敲除，或替换为受体自身的MHC基因，这样也可绕开免疫排斥问题；第三种是将同一供体的造血干细胞与待移植细胞一起植入受体体内，在这种情况下，受体通常会对同一供体来源的其它器官、组织移植物长期耐受，从而避免发生免疫排斥反应。

　　2、克隆动物及转基因动物的生产自绵羊“多莉”(dolly) 问世至今，体细胞克隆动物多有成功的报道。但体细胞克隆动物有着无法克服的弊端，即成功率低和容易早衰。而 Wakayama 等用长期传代 (30 代以上) 的小鼠ES细胞克隆出31只小鼠，14只存活，可见存活率大大提高了。因此，ES细胞克隆动物具有光明前景。 胚胎干细胞是动物克隆的优良核供体，应用干细胞进行动物克隆，可以有效地提高稀有动物的繁殖和高效畜产品的生产，以及高效生物活性物质的生产。

　　一个英国科研小组于2010年9月宣布，他们已经成功制造出两种濒危动物的干细胞。他们以北方白犀牛和非洲鬼狒的皮肤细胞为材料，通过逆转录病毒等现代生物工程工具对这些细胞进行“重置”，制造 出可以分化成为多种功能细胞的干细胞，这些细胞甚至转化为配子（即和卵子）。 这项研究最令人兴奋之处在于它应用于濒危动物保护领域的前景：如果能将它们的干细胞转化为和卵子，就可以利用“试管婴儿”技术保证濒危动物的种群数量。这种方法拥有克隆技术无法比拟的优势，因为“克隆应用在濒危动物身上效果并不理想，成功率很低。此外，干细胞培育技术可以创造出完全不同的基因组合，而不是单独地复制一个已经存在的动物个体”。

　　此外，利用这项技术人们还可以将一些在发育过程中非必需的基因敲除（knock out），在体内进行功能缺失研究； 还可以通过基因功能获得性突变，使特定基因在发育的某一时期表达，从而研究该基因在胚胎不同发育时期中的作用。

　　3、转基因干细胞基因治疗现有的基因治疗有两类： ①转基因细胞治疗， ②核酸治疗。前者常用的基因转移靶细胞多为淋巴细胞，需要反复输注，治疗繁琐。而转基因干细胞技术的建立双赢彩票，解决了转基因细胞存活问题，成为转基因细胞治疗的重要方向。这一方法较传统方法具 有很多优点：低毒性或无毒性，一次药有效；不需要完全了解疾病发病的确切机理；不存在传播疾病的风险；还可能应用自身干细胞移植，避免产生免疫排斥反应。

　　4、为发育生物学研究提供理想的体外模型哺乳动物胚胎体积较小，而且需在子宫内进行发育，因此很难在动物体内连续动态地研究其早期胚胎发育、细胞组织分化及基因表达调控。而来源于胚胎的胚胎干细胞提供了在细胞和分子水平上研究个体发育过程中极早期事件的良好材料和方法。随着分子生物学的发展，通过比较胚胎干细胞不同发育阶段的干细胞和分化细胞的基 因转录和表达，可确定胚胎发育及细胞分化的分子机制、发现新基因。结合基因打靶技术，可发现不同基因在生命活动中的功能等。

　　5、高效新型药物的发现、筛选及动物和人类疾病的模型胚胎干细胞提供了新药物的药理药效、毒理及药物代谢等研究的细胞水平的研究手段。 利用胚胎干细胞体外分化的细胞组织检验筛选新药，可大大减少药物实验所需实验动物的数量及其人群数量。胚胎干细胞还可用来研究动物和人类疾病的发生机制和发展过程，以便找到有效和持久 的治疗方法。

　　总之，干细胞研究对细胞组织移植治疗，体外研究动物、人胚胎的发生发展，新的人类基因发现，药物的筛选和致畸实验及克隆动物、转基因动物等领域将产生重要的影响。dLsct.com，