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　　养, 可使微血管内皮细胞 得到有效 的纯化。 ( 5)密度 梯度离 心法。自从 Panu la等 [ 16] 首次成功培养大鼠脑微血管内皮细 胞以来, 国内外有关大鼠脑微血管 内皮细胞的分离和培养方 法已有较多的报道。近些 年来国 外大多 数方法 采用 以大脑 皮质为材料、 酶消化及梯度离心分 离脑微血管段并进行原代 培养。经胶原酶消化后采用 20% BS 或 15% 葡聚 糖离心可 A 分离脑微血管段与神经组织及大血管, 得到底层的脑微血管 段, 这种方法被广泛 应用于 脑微血 管段的 分离 [ 17, 18] 。 Perr ie ` re等 [19]将经酶消化 后的细胞悬液采用 20% BSA离心, 除去 非内皮细胞。 Ka ll ann 等 [ 20] 采 用 percoll梯度 密度 离心 法, m 将细胞混悬液高速离心, 进一步纯化。 应用于内 皮细 胞纯 化的 方法 还 有 FACS 分类 法 [ 21]、 亚 细胞克隆培养 法 [ 22] 、 Thy111 免疫 反应 杀伤 法 [ 23] 、 磁珠 结合 法 [ 24] 。 3 脑微血管内皮细胞的培养 根据微血管内皮细胞的生长特性, 需要采用一些特殊的 培养条件, 因此脑微血管内皮细胞 的原代培养要注意以下几 点: ( 1) 脑微血管内 皮细胞 的原代 培养需 要涂布 明胶、 鼠尾 胶、 纤连蛋白等基质以利于脑微血 管段贴壁和内皮细胞的生 长脑微血管内皮细胞培养技术的研究进展。U tsum i等 [ 25] 在细胞原代培养中采用 Ô型胶原 包被培养 板, 发现脑微血 管段 贴壁 现象良 好。许雄 飞等 [26] 在尝 试不 同基质后发现其对脑微 血管段 的贴壁 和内皮细 胞的 生长作 用不同, 纤连 蛋白 /Ô型 胶 原优 于鼠 尾 胶, 而鼠 尾 胶比 明胶 好, 而且接种密度的 要求前 者比后两 者要低, 后 两者 需要达 到一定密度才有利于 脑微血管 段贴壁。 另外还 发现 内皮细 胞不易生长于玻片上, 而 较易生长 于塑料 培养皿上 。 ( 2)脑 微血管内皮细胞生长需 要添加 内皮细 胞生长因 子以 促进内 皮细胞的增殖, 抑制杂细 胞的生长。同时也有报道指出在培 养液中添加肝素, 与 内皮细 胞生长因 子起协 同作 用, 对于细 胞的生长和纯化 都极 为有利。 M ilan等 [ 27] 在 细胞 培养 液中 添加 100 L g# L - 1的内皮细胞 生长因 子 ( ECGF) 和 300 un its 的肝素, 以促进 内皮 细胞 生的 生长。 ( 3) 细胞 培养 在原 代、 传代时营养液一般都需要添加血清, 较常用的血清有胎牛血 清、 新生牛血清、 人血清 等。恰当的 控制血 清和 内皮 细胞生 长因子的浓度, 有利 于 B MEC 的生 长、 渐淘汰 混杂 的神经 逐 元和胶质细胞, 对 细胞 纯化 也 起到 一定 的 作用。 一般 情况 下, B MEC 的原代培养需要高浓度的血清。 Yeh等 [ 28] 在培养 人的脑微血管内皮细胞 ( HCEC)时, 培养液中 添加 10% 的胎 牛血清以促进 B MEC 的生长。 4 脑微血管内皮细胞特征鉴定 鉴别内皮细胞的方法有多种, 主要是依据生长形态特征 和特异性抗原的表达。 ( 1)根据 器官和 组织的 来源; 不同器 官和组织起源的内皮细 胞在细 胞形态、 基因 表达、 型和功 表 能特性等方面都不相同。仅就脑微血管内皮细胞而言, 倒置 显微镜下可以进行初步 鉴定, 内皮细 胞呈多 角形 或短梭 形, 单层生长, 有接 触抑 制的 特点, 形 成单 层细 胞时 呈 现 / 铺路 石 0征象 [29] 。内 皮细胞间具有紧密连接或连接复合体, 极少 的胞饮小泡、 缺乏窗孔结构以及含 有选择性双向跨细胞膜转 运系统等独有的特征 [ 30] 。 ( 2) 但仅靠 形态学特 征来 鉴定内

　　脑微血管内皮细胞的体外培养技术, 为脑微血管内皮细胞的 体外研究提供基础。 关键词: 脑; 微血管内皮细胞; 细胞 培养 脑微血管内皮细 胞作为构 成血脑 屏障 ( BBB )的 主要结 构基础的, 由于其特殊的细胞膜转 运系统和细胞间的紧密连 接, 从而在中枢神经系统中的血管 内外物质交换中发挥着重 要的作用。此外脑微血管 内皮细 胞作为 脑微循 环中 的一种 特殊的细胞不仅在脑的 物质代 谢等生 理特性方 面发 挥着重 要的作用, 而且与脑水肿 、 脑血管疾病的发生发展、 脑肿瘤的 浸润和扩散, 尤其 是脑 肿瘤 的血 管生 成等 病理 过 程紧 密相 关 [ 1, 2] 。脑缺血、 水肿 等是 临床 上常 见的 脑血 管 疾病, 对 脑 人类的威胁极大, 且目 前发 现其 发生发 展过 程与 BBB 关系 密切, 脑缺血发生后 BBB的通透性明显增 加 [ 3, 4] 。目前对于 脑缺血等脑血管疾病的研究越来越受到人们的关注, 因此随 着细胞培养技术的发展, 培 养单层生 长的内 皮细 胞, 既为体 外研究 BBB 提供了较 适宜的 培养 体系, 更为 研究 各种 颅脑 疾病提供了一种崭新的 实验工 具, 有 利于从 细胞、 子水平 分 阐述脑缺血等脑血管疾病发生发展的机制。 1 脑微血管段的分离

　　脑微血管内皮细 胞 ( B ra in m icrovascu lar endothe lia l ce lls , B MEC s)培 养 精于 20世 纪 70 年 代末 [ 5], B MECs的 分 离 培 养, 关键在于脑 微血 管段 的分 离和 内 皮细 胞的 获 取、 纯化。 作为 B MECs培养中的第 1个 步骤, 微 血管段 的分 离程度 要 求较高。目前应用的方法主要 有非酶法和酶消化法两种。 1. 1 非酶法 非 酶法应 用较 多的 主要 有 ( 1 )匀 浆器 匀浆; ( 2)直接将组织 切碎至 1 ~ 2 mm3 。由于 微血管具 有一定 的 韧性, 而脑组织脆性较大, 目前 多用匀 浆分离 法分 离微血 管 段。 1. 2 酶消化法 B MECs大 多是 在剪 碎或 使其 匀浆 化后 与 蛋白水解酶共培养不 同的时间 (酶消化法 )后分离出来 。 微血管段的消化 时间是 关系到 内皮细 胞活力 的重要 步 骤, 消化时间过长, 内 皮细胞自 微血管 上脱离 后在 培养液 中 较难存活, 影响内皮细胞 的活力; 反 之, 消 化时 间过 短, 微 血 管内皮细胞的周围组织会影响 细胞的增殖, 并且常常掺 杂一 些未消化开的微血管 周边细胞 ( 如星形胶 质细胞 )dLsct.com，