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　　干细胞发现至今也有几十年的时间了。其自我更新和分化潜能的特征决定了干细胞治疗是一种非常有前景的疗法。近日，干细胞领域大咖Michele De Luca在

　　上发表综述，从造血干细胞、表皮干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞、用于神经再生的多能干细胞等五个角度描述了干细胞治疗的现状和存在的问题。同文章所述一样，目前国内也充斥着各种干细胞治疗乱象。因此，了解干细胞治疗背后的科学依据和临床现状将会有助于行业内外对此进行重新审视。BioArt将该综述重点解读如下，以供读者思考。

　　撰文 图南责编 兮干细胞是一类尚未完全分化的细胞，具有两项最主要的特性：自我更新和分化潜能。干细胞治疗就是利用干细胞的分化潜能，将健康的干细胞移植到患者体内，进而达到组织再生修复的功能。已有的干细胞治疗可以分为自体移植和异体移植。异体移植是从健康人体内获取所需要的干细胞，体外进行扩增培养之后进行移植，但可能存在免疫排斥反应。自体移植则是直接从患者体内获取干细胞之后进行基因编辑修饰，将其转变成健康的干细胞之后进行移植。近三十年来，与干细胞治疗相关的研究如火如荼，在临床应用上展现出了一定的潜力，尤其是针对遗传病和退行性疾病具有独特优势。同时，随着细胞重编程技术和基因编辑技术的进步，成体干细胞及体细胞诱导的多能干细胞也将进一步助推干细胞疗法。然而，尽管近些年来与细胞治疗、基因治疗等相关的临床实验注册数目呈现指数型增长，其中证明有效的病例数目有限，很多临床试验背后的科学依据并不清楚，需要更加谨慎的审视。近日，来自意大利摩德纳大学再生医学中心的干细胞专家Michele De Luca博士领衔在Nature Cell Biology上发表题为Advances in stem cell research and therapeuticdevelopment的综述，概括了近些年来基于不同类型干细胞的临床治疗案例和一些正在进行或即将进行的临床试验，同时分析了这些临床应用背后的科学依据，试验方法以及需要提出的问题。

　　造血干细胞移植技术也就是骨髓移植，是发展最早，也是相对而言最成熟的一种干细胞疗法，临床上主要用于在放疗或者化疗之后补充体内损伤的造血干细胞，进而重塑整个造血系统。1957年，第一批病人在放疗或者化疗之后接受了骨髓移植，而1968年，一个五个月大的患有严重复合型免疫缺陷病的小男孩成功接受了骨髓移植，成为了第一例利用造血干细胞移植治疗遗传性疾病的成功案例。在过去的五十年间，有超过40万人采用了骨髓移植治疗造血系统的恶性肿瘤、遗传或者获得性的造血系统缺陷病。但是，异体造血干细胞移植依旧存在配型困难及免疫排斥反应，这是临床上面临的一个重大挑战。基于造血干细胞的基因疗法则可以很好地解决这一问题。在这种情况下，我们可以从病人的骨髓和外周血中通过分子标记CD34进行纯化，得到CD34+阳性的造血干细胞，然后在其基因组中插入构建携带目标基因的病毒载体，从而得到健康的造血干细胞回输到病人体内。在过去的二十年间，基于造血干细胞的基因疗法成为更加有效地治疗单基因遗传疾病的方式，比如原发性的免疫缺陷病、血红素病变及神经代谢紊乱等。

　　欧盟在2016年批准了第一项基于造血干细胞基因疗法的产品，Strimvelis，用于治疗由腺苷脱氨酶（ADA）单基因引起的严重复合型免疫缺陷病。预计在2020年底，另外五项基于造血干细胞基因疗法的产品在欧盟或者美国也将得以通过审批，进入临床应用，并且还有20项针对不同基因遗传疾病的相关的临床试验也在进行中。这些成功案例都很大程度上得益于干细胞体外培养技术及转基因技术的进步（关于造血干细胞体外培养扩增的最新技术请阅读BioArt的回答：如何看待东京大学成功用PVA（胶水主要成分）培养出大量造血干细胞这一事件？）。

　　然而，基于造血干细胞的基因疗法也有其缺陷。首先，整个治疗过程步骤繁杂，涉及到细胞的收集、转运、编辑及保存，需要建立完善的质量控制标准。其次，病人在接受移植之前，需要接受化疗来清除体内原有的造血干细胞。因此化疗的剂量控制也需要制定相应的标准。更为致命的是，在使用γ-逆转录病毒进行基因修饰的过程中，病毒载体的增强子可能会意外激活内源性的原癌基因，进而引发恶性肿瘤。这促使大家开始转而改用慢病毒载体进行基因修饰，降低致癌风险。目前已有超过150名涉及9种不同遗传病的病人使用了改良版的造血干细胞基因疗法，并取得较好的效果。此外，应用造血干细胞的基因疗法去矫正血红细胞相关的遗传疾病极富挑战性，因为转入的基因很难实现持续可控地血红细胞中特异性表达。两项针对β-地中海贫血症的临床试验中期报告显示，接受治疗的病人可以减轻或者不再需要进行长期的输血。另外一些早期的实验结果显示，造血干细胞基因疗法对镰刀形贫血症、慢性肉芽肿病和范可尼贫血症临床试验也有一定的效果。近些年来，基因编辑技术的进步使得我们能够更加准确地在基因组上特定位置进行编辑矫正，而不是单纯的利用病毒过表达我们需要的基因。这能够帮助我们长时间地追踪移植的细胞，分析它们在病人体内分化成了哪些细胞亚群，如何重新构建造血系统等，同时也证明了造血干细胞的分化潜能。总之，基因编辑技术的成功使得造血干细胞基因治疗更富潜力。

　　表皮干细胞是一类位于表皮基底层的成体干细胞，能够分化得到表皮中的各种细胞类型。1975年，人表皮角质形成细胞体外培养获得成功。随后，该细胞便被用于自体移植治疗大面积的烧伤患者。目前，人表皮角质形成细胞移植已经成为三级烧伤治疗的常规手段。早期研究就发现人表皮角质形成细胞中含有三种细胞类型，分别被称为holoclone, meroclone和paraclone，其成克隆能力依次递减，细胞干性也随之递减。现在我们已经知道holoclone是表皮干细胞移植实验成功的关键所在，其他两种类型的细胞均无法实现长期的表皮更新。同样，角膜缘细胞（ocular limbal cell）中也含有一种角膜上皮干细胞，这对于眼角膜的损伤修复至关重要。角膜缘在化学灼伤的情况下会损失其干细胞，并且在眼角膜中出现血管生成、慢性炎症、角膜混浊和球结膜侵袭等，进而引起视力下降。角膜缘细胞移植能够有效地促进角膜再生和视力恢复。通常情况下，从患者未受伤的眼睛中提取1-2平方毫米的角膜缘就能够进行体外培养，再生出完整的角膜上皮，进行自体移植到受伤的眼部。2015年，自体角膜缘细胞移植（Holoclar）成为欧洲第一例批准的干细胞疗法。角膜缘细胞中也含有一部分holoclone细胞，但是克隆的大小、数目和细胞生长速率均不能够准确预测治疗效果。因此，绝大部分的角膜缘细胞极有可能是瞬时的前体细胞，而不是干细胞。而转录因子p63作为一个重要的调控因子，可以帮助判断角膜缘培养中的holoclone干细胞含量。临床试验结果也表明，p63的表达水平与治疗效果呈正相关，这也是目前找到的唯一的与长期疗效相关的细胞分子标记。

　　除了治疗皮肤烧伤和眼角膜灼伤之外，表皮干细胞自体移植也能够与基因疗法联合起来，治疗一些遗传性疾病，例如大疱性表皮松解症。大疱性表皮松解症是一种罕见遗传病，可细分为四种亚型，其中包括由于LAMA3/LAMB3/LAMC2等基因突变引起的交界性大疱性表皮松解症。由于上述三个基因的突变，患者不能够编码正常的层黏连蛋白332/胶原蛋白17/α6β4整联蛋白。完全缺失层黏连蛋白332的患者都出现早期致死的情况，而在非早期致死型的患者体内层黏连蛋白332表达水平显著降低，这使得病人在受到轻微创伤的情况下便会出现皮肤和粘膜的水疱和糜烂现象。目前没有针对该病的有效治疗手段。然而，基因疗法利用γ-逆转录病毒将正常的LAMB3基因转入患者的表皮干细胞中，并且移植回病人身上，重建其皮肤组织。近期一名7岁儿童患者变受益于此疗法，他的表皮细胞中已经有了正常水平的层黏连蛋白332，且有了完整的基底膜。虽然目前尚未发现该疗法引起恶性肿瘤的案例，但是与造血干细胞基因疗法类似，我们仍然需要开发比γ-逆转录病毒更加安全的病毒载体。对于病人的转基因表皮干细胞谱系分化追踪实验得到了三个重要结论：1. Holoclone形成细胞是表皮干细胞移植成功所必需的；oclones和paraclones是瞬时存在的前体细胞，在移植几个月之后便会消失；3人的表皮是由少数的haloclone细胞维持的，但是这些holoclones是均一的还是具有一定的谱系尚待研究。因此，体外培养的表皮移植体中haloclone干细胞数目的多少决定了该移植体质量。

　　尽管在结构和功能上具有一定的相似性『珍藏版』Nat Cell Bio综述 干细胞疗法研究进展，骨骼肌和心肌细胞从胚胎来源和再生能力上来看具有较大差异。骨骼肌细胞在急性或者慢性损伤的情况下都具有较高的修复能力，而心肌细胞不可再生，因此我们推断骨骼肌中含有一定量的干细胞但是心肌中并没有（关于心肌干细胞请阅读BioArt报道：NBT特别关注丨6位大咖指引心肌干细胞领域“再生”）。我们目前对于心肌细胞知之甚少，并且目前所有针对心肌或者是骨骼肌相关疾病的干细胞疗法都是无效的。就骨骼肌而言，1961年由Mauro发现的肌卫星细胞目前被认为是骨骼肌干细胞。这群细胞位于肌肉膜和基底层之间，并且高表达Pax7。肌卫星细胞对于人体出生后的肌肉生长至关重要，但是在个体性成熟后便进入静息状态，只有在出现肌肉损伤的时候才会被再次激活，分化为肌原细胞修复肌肉纤维，同时自我更新，生成新的肌卫星细胞。尽管在小鼠的细胞移植实验中，肌卫星细胞被证明是具有较强干性的，但是它们在人体中自我更新的能力较弱。1990年，人们试图通过移植肌卫星细胞来治疗杜氏肌营养不良症。然而，虽然在患者体内检测到了供体的肌卫星细胞核，但是移植治疗并没有效果，这很可能是由于移植进去的细胞存活率和迁移能力都较低引起的。一些针对局部性的肌肉损伤修复的肌卫星细胞移植实验取得了一定的成效，比如括约肌失禁治疗等。然而由于患者本身的多样性，目前尚没有明确的结论。除卫星细胞之外，肌肉中还存在其他的一些细胞类型，包括最近鉴定出来的Pw1阳性细胞。虽然它们都不是干细胞，但是有一些细胞类群参与了肌肉的生长与修复，比如中成血管细胞。然而中成血管细胞的移植却收效甚微，这可能是因为移植细胞的存活率太低。与骨骼肌干细胞不同，心肌干细胞并没有广泛认可的特定细胞类型。近二十年来的研究针对不同的心血管疾病及多种细胞类型。2001年，一项充满争议的研究声称骨髓移植有利于治疗心肌梗塞，然而其他课题组却无法重复这项研究结果。人们猜想骨髓移植可能是通过旁分泌的方式促进心肌细胞的存活及血管生成来发挥作用的。另一项研究则表明，心脏细胞在发育过程中是可以分化为其他细胞的，但是这在成年人体内不会发生。利用重编程或者是胚胎干细胞分化得到的心肌前体细胞在动物体内实验有一定成效，能够可控的分化成各种心脏细胞类型，但是这种技术手段仍然面临体外细胞扩增困难及免疫排斥的问题。此外，这种途径得到的心肌细胞只有正常心肌细胞的三分之一大小，容易引发心律失常。另一种方案是直接促进内源性的心脏再生，避免细胞移植问题。比如，激活内源性的心肌祖细胞或者诱导纤维细胞转分化为心肌细胞，原位诱导细胞部分重编程或者使用外部的心脏补片。总之，目前我们对于肌肉细胞的干细胞或者是祖细胞的了解尚不够深入。未来的临床试验还需要更加深入的基础研究作为理论依据。

　　Friedenstein和Owen在骨髓中发现一类具有成克隆能力，可以分化得到软骨、骨、造血支持基质和骨髓脂肪细胞的细胞类群。鉴于这些细胞具有多能性，能够分化得到其谱系之外的中胚层结缔组织，例如肌肉、肌腱、韧带及脂肪组织等，人们将其命名为间充质干细胞。然而严格意义上讲，这个名称并不准确。首先，间充质存在于胚胎中，能够分化得到各种结缔组织，血液和血管等。任何成体干细胞都不具有这一类特性。其次，不同的结缔组织来自于不同的特化的神经嵴及中胚层细胞。无论是在胚胎发育过程中还是出生之后的个体中，都不存在公共的间充质干细胞。尽管间充质干细胞的理论基础并不扎实，但是它们已经被用于超过900项临床试验，治疗多种类型的疾病。它们在被移植之后会很快消失，可能是通过旁分泌的方式发挥功能。这与传统意义上的利用干细胞进行组织再生大不相同，因此严格意义上讲它们并不应该归为干细胞治疗的范畴。从少数几个已经披露的实验结果来看，间充质干细胞的治疗效果往往达不到预期。此外，很多人付钱进行一些未经审批注册的间充质干细胞移植实验。他们使用未经纯化的骨髓或者是吸脂吸出物进行移植，其结果很有可能患者是有害的，比如有人在注射吸脂吸出物之后出现了急性失明症状。因此，目前基于间充质干细胞的治疗亟需规范化的管理。事实上，所谓的间充质干细胞中的确存在一些组织特异的干细胞或者是前体细胞，但是它们不应该被笼统的命名为间充质干细胞，而应该根据其来源和分化去向进行更为细致的分类。比如在脂肪组织中得到的前体细胞应该命名为脂肪干细胞，因为他们来自于脂肪组织且能够分化为脂肪细胞。另外，目前已有的很多用于鉴定间充质干细胞的细胞分子标志并不可取。在人体的多种组织中都存在CD146阳性及CD45/31双阴性的细胞，尽管它们有共同的分子标记且都具有很好的成克隆能力，但是转录组上的差异却非常大。更为深入的研究发现，不同来源的这类细胞只能分化为本身特定的细胞类型，而不能够分化为其他谱系的细胞。这也进一步证明，利用分子标记来鉴定细胞类群并不是万无一失的。目前的确也有少数的间充质干细胞治疗成功的临床案例。比如，骨髓干细胞移植用于治疗大量的骨缺失和牙髓再生。然而在这两个案例中，都没有足够的证据表明再生的组织来源于移植的干细胞。因此在临床应用之前，我们需要对间充质干细胞进行更为深入的研究，尤其是对其中可能存在的干细胞进行细致的鉴定。

　　成年人神经系统的再生能力较弱，且老年人体内的神经细胞退化严重，容易导致各种神经退行性疾病，比如帕金森、亨廷顿、视网膜退行性疾病、中风等。而胎儿的细胞具有较强的再生能力，因此移植胎儿细胞可以取代退化的神经元。尽管这一疗法确有效果，但是细胞来源非常困难。以帕金森病为例，患者中脑中的多巴胺能神经元逐步退化消失，进而引起多巴胺水平过低，患者行动障碍。目前主要的治疗手段是使用多巴胺能药物，提升多巴胺水平。该药物早期对于患者有一定效果，但是长期使用会产生副作用，比如运动障碍和神经精神并发症。理论上，我们如果能够重建患者大脑中的多巴胺能神经元，就可以有效治疗帕金森病。因此在30年前便有人尝试移植胎儿的中脑组织给病人，随后在欧洲、美国及加拿大均有类似的临床案例。比较这些实验的结果发现，尽管疗效因人而异，但是胎儿细胞移植疗法的确能够重建多巴胺能神经元。由于胎儿细胞来源的稀缺性，进行胎儿细胞移植并不具备普适性。1998年人体胚胎干细胞的培养成功及2007年人体诱导多功能干细胞的出现为干细胞疗法提供了新的细胞来源。目前已有实验表明，人体胚胎干细胞能够诱导分化成为类似多巴胺能神经元。更为重要的是，由这些干细胞分化得到的多巴胺能神经元及其前体细胞在功能上和分子表达谱上都与胎儿中脑细胞非常相似，这为临床应用提供了更加充分的理论依据。目前已有来自世界各地的多家医疗中心准备开始相关的临床试验，这将是攻克帕金森病及其他神经退行性疾病的重要一步。