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　　广州医学院硕士学位论文新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究姓名：****学位级别：硕士专业：心内科指导教师：**风20070517广州医学院２００４级硕士研究生学位论文英文缩写中英文对照与缩写词英文全称中文全称ＨＳＣｓＨａｅｍａｔｏｐｏｉｅｆｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ造血干细胞ＭＳＣｓＭｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ间充质干细胞ＣＳＣｓＣａｒｄｉａｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓＤＰＢＳＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＰｈｏｓｐｈａｔｅ－ＢｕｆｆｅｒｅｄＳａｌｉｎｅ心肌干细胞磷酸盐缓冲液（无Ｃａ２＋，Ｍｇ＋）ＩＭＤＭＩｓｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ常用细胞培养基ＩＤＭＥＭＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ常用细胞培养基２ＲｈＥＧＦＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＢＦＧＦＢａｓｉｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒＣＴ一１Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ－１ＣＴｎＴ表皮生长因子碱性成纤维细胞生长因子心营养素一１心肌钙蛋白ＴＣＥＭＣｏｍｐｌｅｔｅＥｘｐｌａｎｔＭｅｄｉｕｍ完全移植物培养液ＣＧＭＣａｒｄｉｏｓｐｈｅｒｅ．ＧｒｏｗｉｎｇＭｅｄｉｕｍ心肌生长培养液广州医学院２００４级硕士研究生学位论文ＲＴ．ＰＣＲ流式细胞术ＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＰｏｌｙｍｅｒａｓｅＣｈａｉｎ逆转录聚合酶链式Ｒｅａｃｔｉｏｎ反应ＩＭＦｓＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ免疫荧光技术广州医学院２００４级硕士研究生学位论文新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究硕士研究生：李妍导师：**风教授中文摘要背景：成体心脏内存在具有特异性心肌分化潜能的多能干细胞，成体心肌于细胞（ＣａｒｄｉａｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓＣＳＣ）是存在于发育成熟机体心脏组织中的具有高度自我更新和特异性心肌分化、增殖潜能的未分化细胞。它具有以下几点主要的细胞生物学特性：具有克隆能力、能够自我更新和有多能性；能迅速发育成结构和功能成熟的心肌细胞和血管系统；只需在损伤局部激活、迁移，不需采集和扩增。目的：研究新生小鼠心肌干细胞原代和传代的培养及其分化潜能，为缺血及坏死心肌重建的临床应用提供科学依据。内容：１．在过去研究方法的基础上，进行改良，成功建立一种更加稳定、高效的体外成体心肌干细胞分离、纯化的方法。２．诱导心肌干细胞分化为搏动的心肌细胞。３．通过免疫荧光技术、流式细胞仪、ＲＴ－ＰＣＲ等鉴定方法，基本明确细胞表型，并将原有的方法与改良后的方法进行比较。方法：１．原有的方法是组织块贴壁法，仅仅使用眼科剪刀将心肌组织剪碎，用培养液润洗后，必须要等待组织块贴壁之后才能添加培养液，组织块很容易漂浮起来。经过不断的观察和实验，将原有方法进行改良，采用微小组织块悬浮贴壁法，在用剪刀将心肌组织剪碎的基础上，经过胰酶消化，弃去消化液，使用胶头滴管反复吹打组织块后离心，加入ＣＥＭ培养液重悬后进行培养。２．待其长满培养瓶后进行传代，传代细胞用ＣＧＭ培养液进行培养，约１－２周可见单个搏动的传代细胞，也可见成团细胞的同步收缩。３．免疫荧光染色法标记原代与传代细胞，在共聚焦显微镜下观察细胞表面是否带广州医学院２００４级硕士研究生学位论文有ｃ．ｋｉｔ新生小鼠心肌干细胞培养与分化的研究、Ｓｃａ－１、ＭＨＣＩＩ荧光。４．流式细胞仪鉴定原代与传代细胞表面标记ｃ－ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ３４、ＣＤ８。５．半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测原代与传代细胞心肌转录因子ＧＡＴＡ－４的表达。结果：１．采用改良后的方法从消化后的心肌组织块中成功培养得到原代细胞，进行免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为ｃ．ｋｉｔ、Ｓｃａ－１阳性的细胞，表面不表达ＣＤ３４、ＣＤ８、ＭＨＣＩＩ。２．细胞经传代后培养ｌ周左右，开始出现搏动，也可见成团细胞的同步收缩。再次经免疫荧光染色、流式细胞仪鉴定其表型为ｃ．ｋｉｔ、ｓｅａ－１阴性，ＭＨＣＩＩ阳性，仍然不表达ＣＤ３４、ＣＤ８。３．半定量ＲＴ－ＰＣＲ检测原代细胞不表达心肌转录因子ＧＡＴＡ－４，而传代培养１周后的细胞开始表达ＧＡＴＡ－４。４．统计学方法分析实验结果，原代及传代培养的细胞共经过８次流式细胞仪检测表面标记物阳性的细胞所占的百分比后，所得到的数据采用ＳＰＳＳｌｌ．５软件包进行统计学处理，采用配对样本的ｔ检验方法来比较表面标记物阳性的原代与传代细胞所占百分比的差异，，值代表两者之『自】的差异性，以Ｐ＜０．０５为有统计学意义。其中ｃ．ｋｉｔ、Ｓｃａ－１、ＭＨＣＩＩ三种抗体阳性的细胞所占百分比的尸值小于Ｏ．０５，差异有显著性；而ＣＤ３４、ＣＤ８两种抗体阳性的细胞所占百分比的Ｐ值大于０．０５，无统计学意５．另外，采用两样本的ｔ检验方法比较同一批培养的原代和传代细胞，分别使用原方法与改良后的方法进行培养，所得到的细胞表面标记物阳性所占百分比的差异，Ｐ值代表两者之间的差异性，以Ｐ＜０．０５为有统计学意义。经过分析后发现无论是原代细胞还是传代细胞，分别使用两种方法的ｃ．ｋｉｔ、Ｓｃａ—ｌ、ＭＨＣＩＩ三种抗体标记的阳性细胞所占百分比的Ｐ值均小于Ｏ．０５，两者的差异有显著性，有统计学意义。结论：１．在原有方法的基础上，通过对其进行改良，从新生小鼠的心脏中成功分离得到纯度更高、活性更好的心肌干细胞，其表型为ｃ—ｋｉｔ＋、Ｓｃａ－Ｉ＋、ＣＤ３４‘、ＣＤ８‘、ＭＨＣＩＩ‘，ＲＴ－ＰＣＲ检测其不表达心肌转录因子ＧＡＴＡ－４。２．经过传代培养之后，分化为能够搏动的心肌细胞，细胞表面标记变为ｃ—ｋｉｔ＂、广州医学院２００４级硕士研究生学位论文Ｓｅａ－１’、ＣＤ３４’、ＣＤ８‘、ＭＨＣＩＩ＋，并且开始表达ＧＡＴＡ－４。【关键词】心肌干细胞；心肌再生；心肌缺血广州医学院２００４级硕士研究生学位论文ＡｂｓｔｒａｃｔＳｔｕｄｙｏｎＣｕｌｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆＣａｒｄｉａｃＳｔｅｍＣｅｌｉｓｆｒｏｍｎｅｏｎａｔａｌｍｏｕｓｅＬＩＹａｈ，ＬＵＤｏｎｇ－ｆｅｎｇ（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＣａｒｄｉｏｌｏｇｙＳｅｃｏｎｄＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌＧｕａｎｇｚｈｏｕＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ，Ｇｕａｇｎｚｈｏｕ５１０２６０，Ｃｈｉｎａ。）Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ：ＭｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓｈａｖｅｔｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｏｔｅｎｔｉａｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｔＯｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｓｉｎａｄｕｌｔｈｅａｒｔ．Ａｄｕｌｔｃａｒｄｉａｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓ（ｃｓｃ）ａｒｅｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｆｈｉ＃１ｌｙｓｅｌｆ－ｒｅｎｅｗａｌａｎｄｓｐｅｃｉａｌｌｙｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄａｎｄｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｅｄｐｏｔｅｍｉａｌｍｙｏｃａｒｄｉａｌｃｅｌｌｓｉｎｍａｍｒａｌｈｅａｒｔ．Ｉｔｈａｓｔｈｅｆｏｌｌｏｗｉｎｇｍａｊｏｒｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ：１．ｔｈｅ ａｂｉｌｉｔｙ ｍａｔｕｒａｌｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｓａｎｄｖａｓｃｕｌａｒ ｓｙｓｔｅｍ；３．ｏｎｌｙ ｎｅｅｄｔＯｂｅ ｐａｒｔｉａｌｌｙ ａｃｔｉｖａｔｅｄａｎｄ ｍｉｇｒａｔｅ ｔｏｔｈｅ ｉｎｊａｒｉｅｄｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎｎｏａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．ｏｂｊｅｅｔｉｖｅ： Ｔｏ ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅ ｐａｓｓａｇｅｄｃａｒｄｉａｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｆｒｏｍｎｅｏｎａｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｐｒｏｖｉｄｅａｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｂａｓｉｓ ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｔｂｅｃｌｉｎｉｃａｌａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｉｓｃｈｅｍｉａａｎｄｎｅｃｒｏｓｉｓ． Ｃｏｎｔｅｎｔｓ： １．Ｂａｓｅｏｎｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓｍｅｔｈｏｄａｎｄｍｏｄｉｆｙｉｔ，ｗｅ ｓｕｃｃｅｅｄｔＯｅｓｔａｂｌｉｓｈｏｆｍｏｒｅｓｔａｂｌｅａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｍｅｔｈｏｄｏｆ ｓｅｐａｒａｔｉｎｇ ｐｕｒｉｆｌｃａｔｉｎｇａｄｕｌｔｃａｒｄｉａｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｖｉｔｒｏ． ２．Ｉｎｄｕｃｅｃａｒｄｉａｃｓｔｅｍｃｅｌｌｓｉｎｔｏ ｂｅａｔｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｓ． ３．Ｍａｋｅｃｅｌｌ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｃｌｅａｒ ｂｙｉｍｍｕｎｏｆｉｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ，ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄＲＴ－ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄｓ．Ａｎｄｃｏｍｐａｒｅ ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｏｆｔｈｅ ｐｒｅｖｉｏｕｓ ｍｅｔｈｏｄｓｗｉｔＩＩｔｈｅ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ： １．Ｉｎｔｈｅ ｐａｓｔ，ｗｅ ｕｓｅｄｔｈｅｔｉｓｓｕｅａｄｈｅｓｉｖｅｍｅｔｈｏｄ，ｔｈａｔｏｎｌｙ ｕｓｅａ ｐａｉｒ ｏｆｓｃｉｓｓｏｒｓｔＯｃｕｔ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｔｉｓｓｕｅｉｎｔＯ ｐｉｅｃｅｓ．Ａｆｔｅｒ ｔｈｅｍｅｄｉｕｍｗａｓｈｉｎｇ，ｔｈｅｔｉｓｓｕｅ ｐｉｅｃｅｓ ａｄｈｅｒｅｎｔｔｏｔｈｅ ｆｌａｓｋａｎｄａｄｄｔｈｅｍｅｄｉｕｍ．Ｔｈｅｎｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｐｉｅｃｅｓ ｆｌｏａｔ ｕｐｅａｓｉｌｙ．Ａｆｔｅｒｔｉｍｅｓｏｆ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｎｄｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｅ ｕｓｅｔｈｅｍｏｄｉｆｉｅｄｍｉｎｉｍａｌｔｉｓｓｕｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ａｄｈｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｔｏｃｕｌｔｕｒｅｔｈｅｃｅｌｌｓ．Ｏｎｔｈｅｂａｓｅｏｆ ｕｓｉｎｇ ｐａｉｒｏｆｓｃｉｓｓｏｒｓｔｏｃｕｔｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ，ａｆｔｅｒ ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ，ｔｈｅｎ ｕｓｅｔｈｅｄｒｏｐｐｅｒ ｂｅａｔｕｐｏｎ ｒｅｍａｉｎｉｎｇｔｉｓｓｕｅｓ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｓ．Ｔｈｅｒｅｍａｉｎｉｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓｗｅｒｅｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎ ｃｏｍｐｌｅｔｅｅｘｐｌａｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ（ＣＥＭ）． ２．Ｗｈｅｎｔｈｅｃｅｌｌｓｃｏｖｅｒｅｄｃｕｌｔｕｒｅ—ｆｌａｓｋｗｅｐａｓｓａｇｅ ｉｔ．Ａｆｔｅｒａｂｏｕｔｏｎｅｗｅｅｋｎｏｔｏｎｌｙ ｗｅ ｃａｎｓｅｅｔｈｅ ｂｅａｔｉｎｇｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｂｕｔ ａｌｓｏＣａｎｓｅｅｔｈｅｃｅｌｌｓ ｓｙｎｃｈｒｏｎｉｚｅｄ ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ． ３．Ｕｓｅｔｈｅｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｔｏｓｔａｉｎｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｐａｓｓａｇｅｄｃｅｌｌｓａｎｄｏｂｓｅｒｖｅｔｈｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｍａｋｅｒｓｏｆｃ．ｋｉｔ．Ｓｃａ－Ｉ，ＭＨＣｃｌａｓｓＩＩｕｎｄｅｒｔｈｅｃｏｎｆｏｃａｌｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ． ４．１ｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｅｔｈｅｍａｒｋｅｒｏｆｃ－ｋｉｔＳｃａ－Ｉ，ＭＨＣ ｃｌａｓｓＩＩ，ＣＤ３４，ＣＤ８ｏｎｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｐａｓｓａｇｅｄｃｅｌｌｓ ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． ５．Ｓｅｍｉ．ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＲＴ－ＰＣＲｄｅｔｃｃｔｅｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｇｅｎｅＧＡＴＡ－４ｏｎｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｐａｓｓａｇｅｄｃｅｌｌｓ． Ｒｅｓｕｌｔｓ： １．Ｗｅｕｓｅｔｈｅｉｍｐｒｏｖｅｄ ｍｅｔｈｏｄｔｏｃｕｌｔｕｒｅｔｈｅ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅｓ，ａｎｄｇｅｔ ｔｈｅｂｅｔｔｅｒｒｅｓｕｌｔｓ ｔｈａｎｔｈｅ ｏｒｉｇｉｎａｌ ｍｅｔｈｏｄ．Ｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄＩｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｐａｓｓａｇｅｄｃｅｌｌｓ． ２．Ｔｈｅ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｅｌｌｓａｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｃｕｌｔｕｒｅｄｆｒｏｍｔｈｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄｍｙｏｃａｒｄｉａｌｔｉｓｓｕｅ，ｂｏｔｈdLsct.com，