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　　细胞培养肉是指用畜禽干细胞通过体外培养生产出的肉类，是一种新兴肉类生产技术，其优势是低碳环保，未来可作为传统肉类的替代蛋白供应。 肌肉干细胞是培养肉重要的种子细胞之一。肌肉干细胞是肌肉组织里的专能干细胞，当肌肉组织出现损伤时，肌肉干细胞可有效修复和再生肌纤维。在肌肉干细胞的大规模培养过程中，由于细胞的贴壁生长特性，不管在2D培养皿还是3D微载体上，极易出现密度较高的情况。

　　南京农业大学食品科学技术学院的林玲，丁世杰*，周光宏*等通过对猪肌肉干细胞转录组分析及验证并系统性地探究高密度培养对猪肌肉干细胞命运的影响，旨在为细胞培养肉研究在高密度条件下调节细胞增殖分化提供一定参考依据。

　　为探究不同接种密度短期培养对肌肉干细胞的影响，将分离得到的猪肌肉干细胞传至第5代后以不同密度接种至细胞培养皿。从图1A可以看到，肌肉干细胞大部分呈梭状，部分刚完成分裂的肌肉干细胞呈圆形。随着接种密度提高，细胞相互接触程度逐渐增强，最高密度组细胞完全接触，细胞表现出融合分化的趋势。将细胞消化计数，结果显示终密度分别为1.780×10 4 、3.226×10 4 、5.066×10 4 、6.264×10 4 cells/cm 2 （图1B），细胞分别增殖了6.59、5.97、4.60、2.85 倍（图1C）。3组细胞扩增倍数相比对照组分别减少了9.3%、28.8%、56.0%。

　　为了从分子水平进一步了解高密度对猪肌肉干细胞增殖的影响，本研究以磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）蛋白的表达情况进一步分析。如图2所示，不同密度接种培养3d后的细胞ERK蛋白水平在前3个密度下无明显变化，最高接种密度组p-ERK1下调为对照组的58.6%（图2B）。类似的，最高密度组p-ERK2下调为对照组的57.7%（图2C）。综上所述，猪肌肉干细胞在3d内的扩增倍数随接种密度升高而逐渐下降，且下降幅度随接种密度升高而加大。同时高密度培养下p-ERK蛋白的表达量下调，进一步证实高密度培养抑制猪肌肉干细胞增殖。

　　上述结果表明，高密度培养的猪肌肉干细胞增殖受到显著抑制，为了系统性了解高密度接种条件下细胞基因表达谱的变化，对2.7×10 3 cells/cm 2 （对照组，L-D3）和2.2×10 4 cells/cm 2 （实验组，H-D3）两组细胞样品进行转录组测序，将测序结果进行主成分分析（PCA）、基因差异表达分析、差异基因京都基因与基因组百科全书（KEGG）信号通路分析。如图3A所示，实验组与对照组的离散程度较大，表明两组样品的差异性较大。据测序结果，选取log 2 Fold change绝对值大于1，即细胞的基因表达在处理组和对照组中表达量上调/下调超过2倍的基因进行差异 表达分析。如图3B所示，和对照组相比，H-D3组显著上调超过2倍的基因共1301个，显著下调2倍的基因共824个。如图3C所示，H-D3与L-D3两组中差异表达基因主要富集在细胞衰老、PI3K-Akt信号通路和细胞周期等通路。这些结果表明，高密度培养更易发生细胞衰老、细胞周期蛋白表达异常变化，这些信号通路的变化可能是造成高密度下猪肌肉干细胞增殖减缓以及干性衰退的重要原因之一，有待于进一步研究。

　　通过筛选每千碱基外显子的序列片段数（FPKM）发现，对照组PAX3和PAX7的FPKM较低，而高密度条件下PAX3和PAX7的表达量有一定上调（图4A、B）。另外，Sprouty1（SPRY1）是酪氨酸激酶受体信号传导抑制基因，通常在静息状态下PAX7阳性的肌肉干细胞中高表达，随着肌肉干细胞的激活，表达量逐渐下调。肌肉干细胞在修复损伤后，SPRY1是一部分肌肉干细胞重新变成静息状态下，维持干细胞池稳态必不可少的基因。SPRY1基因的FPKM结果显示，高密度条件下该基因也出现了上调表达（图4C），表明高密度条件下部分猪肌肉干细胞可能转变成了静息状态下的干细胞。

　　针对分化相关基因MYOD和MYOG的转录组学数据分析结果显示（图4D、E），表征分化起始的基因MYOD和表征分化进程中后期的标志性基因MYOG在高密度培养3 d条件下上调。另外，胚胎骨骼肌肌球蛋白重链3（MYH3）表征细胞分化形成新生肌管，其随着密度升高而上调表达进一步表现了分化进程（图4F）。以上结果表明，高密度可能推动了肌肉干细胞的分化进程。

　　转录组学信号通路分析结果显示，高密度条件下细胞发生了衰老，对标志性的衰老基因进行了分析。研究发现P21参与甲基化介导的生物体衰老过程，P53是细胞衰老的主要调节因子，敲除P15等能有效抑制人类真皮干细胞的衰老。因此P21、P53和P15作为经典的衰老相关基因，被选为分析衰老基因表达变化的目标基因。P21、P53和P15基因的FPKM的结果显示（图4G～I），3 个衰老基因的表达都出现了上调，表明高密度条件下部分猪肌肉干细胞可能出现了衰老。

　　经过蛋白免疫印迹检测，如图5A所示，与对照组相比，5.4×103、1.1×104、2.2×104 cells/cm2组PAX7的蛋白表达水平分别上调到1.70、2.66、2.70倍，高密度培养显著上调PAX7的蛋白表达（P＜0.01）。本研究结果显示，SPRY1在转录水平上随着接种密度的升高而升高，和对照组相比，5.4×103、1.1×104、2.2×104 cells/cm2组分别上调到1.07、1.25、1.81 倍，最高密度组的SPRY1表达显著升高（P＜0.01）（图5B）。结果表明，猪肌肉干细胞在一定的高密度培养条件下，可能是通过SPRY1的作用，让一部分肌肉干细胞由激活状态重新变成静息状态，从而上调了PAX7的表达。以上结果表明在相同的培养时间内，猪肌肉干细胞的干性随接种密度升高而升高。

　　为了检测高密度培养对肌肉干细胞分化能力的影响，利用real-time PCR和Western Blot检测了分化关键基因MYOG的表达。如图5C所示，realtime PCR结果显示，和对照组相比，5.4×103、1.1×104和2.2×104 cells/cm2组的MYOG在转录水平分别上调到2.08、10.68、68.35 倍，最高密度组比对照组有显著上调（P＜0.05）。在蛋白水平，5.4×103、1.1×104、2.2×104 cells/cm2组的MYOG蛋白水平分别上调到1.42、1.36、4.13 倍，最高密度组显著上调（P＜0.001），以上结果说明在高密度培养条件下，部分肌肉干细胞进入了细胞的分化进程。

　　转录组学研究显示，高密度培养抑制肌肉干细胞增殖，且高密度下衰老相关通路中的P21等基因显著上调，为了验证转录组学的研究结果，检测了衰老相关基因P21的表达。如图5D所示，培养3d后P21的转录水平随着接种密度的升高而升高，5.4×103、1.1×104、2.2×104 cells/cm2组分别上调为对照组的1.72、3.25、4.29 倍，高密度两组显著上调（P＜0.01）。因此，在高密度条件下，细胞周期蛋白的表达变化可能是细胞增殖能力变化的潜在原因，但其上游通路中基因的表达情况还需要进一步研究。

　　以上结果表明，高密度培养条件一方面促使部分细胞进入静息状态维持干细胞池；另一方面推动部分细胞肌源分化，同时还导致了一定数目细胞的衰老。

　　已有大量研究表明，动物细胞在高密度培养条件下会发生“接触抑制”现象，即细胞的增殖能力显著下降。研究发现p27Kip1上调、cyclin A下调是星形胶质细胞增殖产生接触抑制的原因。加入外源性表皮生长因子（EGF）能提高高密度下的细胞增殖并形成多个细胞层。但EGF的加入并不能很大程度地改变p27Kip1和cyclin A的水平，而是提高了cyclin D1的水平。在FH109人胚胎成纤维细胞中，接触抑制仅通过相邻细胞上两种细胞蛋白的相互作用介导，即通过糖蛋白接触抑制素与之结合，受体称为接触抑制素受体。肿瘤抑制因子p16lnk4和Cdk4之间缔合的增加以及p27Kip1和Cdk2/cyclin E复合体的缔合增加会产生抗增殖信号《食双赢彩票官方网品科学》：高密度培养对猪肌肉干细胞命运的影响，从而导致细胞阻滞在G1期。最后的结果是视网膜母细胞瘤基因产物保持低磷酸化状态，从而抑制其进入细胞周期S期的进程。因此，密度引发的细胞周期通路变化是细胞接触抑制最直接的原因。Leontieva等研究发现，细胞衰老分两步发生，首先是细胞周期停滞，这部分可由高密度引起并且可逆，第二步是衰老转化，将可逆的停滞变为不可逆的衰老，这部分与mTOR信号通路相关。本研究结果显示，在高密度条件下，猪肌肉干细胞也出现了明显的接触抑制现象，相关细胞衰老和周期基因出现了上调。另外，本研究转录组学也揭示了相关差异蛋白富集到了PI3K-Akt信号通路，与前人的结果吻合。

　　PAX7是肌肉干细胞的干性标志基因，结果表明细胞干性随接种密度升高而增加。进一步研究调节肌肉干细胞可逆的静止激活状态的基因SPRY1发现，SPRY1随着密度的上升逐渐升高。SPRY1通常在静息状态下PAX7阳性的肌肉干细胞高表达，随着肌肉干细胞的激活表达量逐渐下调。若降低SPRY1的表达，则会显著减少静息状态下的肌肉干细胞并且提高了凋亡的细胞比例。另外，研究发现SPRY1的作用可能是通过抑制ERK信号通路实现。本研究也发现了高密度培养下磷酸化ERK蛋白的表达量下调。但在高密度条件下，SPRY1调节猪肌肉干细胞的PAX7的表达还需要深入研究。

　　高密度培养条件还会影响细胞的分化。例如，在角质细胞分化方案中增加初始hPSC接种密度会增加分化终末K18＋/p63＋简单上皮细胞的数量，提高细胞纯度。Hsiao等研究发现，在贴壁情况下，hPSC分化为神经上皮祖细胞和神经元的动力学水平和分化程度以YAP依赖的方式受细胞接种密度影响，细胞接种密度越高，分化程度越高。Singh等研究了胚胎干细胞向FLK1＋血管祖细胞的分化转变与细胞密度和细胞代谢的关系，发现这种转变依赖于较高的接种密度，且与代谢物的转变有关。在间充质干细胞中，有研究得到基质弹性和细胞密度是驱使人间充质干细胞增殖和分化的重要微环境因素。高密度培养后的骨髓间充质干细胞，其成骨分化程度更高并伴随着ERK蛋白表达的下降。高密度培养也改变了牙髓干细胞的特性，并通过整合素信号的传导产生了更多致力于成骨分化的细胞。在本研究中，也发现了高密度条件会促进成肌细胞的分化进程。

　　肌肉干细胞在高密度培养条件下产生接触抑制，增殖减缓。本研究通过转录组学和后续的验证，发现高密度培养一方面促进部分细胞进入静息状态维持干细胞池，表现为干性基因上调；另一方面，高密度促进细胞分化进程，表现为分化相关基因上调；此外，高密度还导致了细胞衰老，表现为衰老基因上调。本研究结果有助于理解高密度下细胞命运决定机制，为细胞培养肉研究在高密度条件下调节细胞增殖分化提供一定的理论基础。

　　周光宏，教授，南京农业大学国家肉品质量安全控制工程技术研究中心主任。现任肉品质量控制与新资源创制全国重点实验室和国家肉品质量安全控制工程技术研究中心主任，兼任中国畜产品加工研究会会长和国际标准化组织“肉禽鱼蛋及其制品”委员会主席，是我国肉品加工学科带头人和本领域国际知名专家。肉品加工是我国现代农业产业体系的重要组成部分，关系国计民生。周光宏教授在我国率先系统开展了肉品科学基础和应用研究，针对我国生鲜肉质量安全难以控制、肉制品加工技术落后、肉类生产和资源禀赋矛盾日益突出的重大产业问题，1）攻克了冷却肉质量控制难、冷却干耗大、保质期短的产业技术难题；2）揭示了由肌肉内源酶主导的我国传统腌腊肉制品风味形成机制，研发出肉品风味与凝胶品质控制技术；3）创制出中国第一块细胞培养肉，为我国肉类生产可持续发展提供了新的技术储备。

　　林玲，南京农业大学食品科技学院科研助理，女，汉族，1995年出生于江苏启东，本科和硕士阶段均就读于南京农业大学食品科技学院，攻读食品科学与工程专业。本科期间加入院科协，获得“第十三届南京高校学生食品科技论坛二等奖”、“三好学生一等奖学金”和“校优秀毕业生”等荣誉。研究生期间进入国家肉品中心进行细胞培养肉研究，毕业后进入南京周子未来食品科技有限公司任研发助理，目前在周光宏教授课题组做科研助理。

　　本文《高密度培养对猪肌肉干细胞命运的影响》来源于《食品科学》2023年44卷第18期165-174页，作者：林玲，朱浩哲，蒋翊宸，郑燕燕，刘政，吴中元，丁世杰，周光宏。DOI:10.7506/spkx0928-315。点击下方阅读原文即可查看文章相关信息。

　　实习编辑；北京林业大学生物科学与技术学院栾文莉；责任编辑：张睿梅。点击下方阅读原文即可查看全文。图片来源于文章原文及摄图网。

　　非热加工专栏：江苏大学邹小波、石吉勇教授等：米糠非热稳定化处理技术研究进展