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　　目前已经得到了若干真核细胞克隆化基因,如β-珠蛋白基因,TK基因等。利用显微镜操作把这些基因注入到小鼠受精卵的核中,再把受精卵植入到生殖管道中,发育成的个体不仅能表达注入基因决定的性状,而且能把该基因传到第二代。这方面最成功的例子是“超级小鼠的诞生。这些小鼠生长快,74d时的体重就接近同窝正常小鼠的两倍。这一成果的意义不仅为遗传工程和遗传疾病(如巨人症)的研究提供了模型,而且也为加速经济动物的生长提供了新的技术途径。一、干细胞及干细胞技术简介二、ES/EG细胞培养建系技术（一）、ES细胞的分离（二）、饲养层细胞饲养法（三）、无饲养层培养（四）、ES细胞的原代培养和继代培养（五）、ES/EG细胞系的特性和鉴定三、干细胞应用（治疗失明）干细胞技术一、干细胞简介一、干细胞简介1、定义干细胞（stemcell）：是指具有无限或较长期的自我更新能力，并能产生至少一种高度分化子代细胞的细胞2、分类根据细胞分化潜能大小：全能干细胞（totipotentstemcell）三胚层多能干细胞（pluripotentstemcell单胚层多能干细胞（multipotentstemcell单能干细胞（monopotentstemcell根据细胞来源不同：干细胞胚胎性干细胞：指源于囊胚内细胞团（ISM）的胚胎干细胞（ES）。它均属于三胚层多潜能性干细胞。如：ES细胞、EG细胞、EC细胞等。成体干细胞：是指那些具有组织特异性的细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳定，具有修复和再生能力，能够产生新的干细胞，或者能按一定的程序分化，形成新的功能细胞，使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。如：神经干细胞，表皮干细胞。ES细胞：存在于早期胚胎内细胞团的全能干细胞。EG细胞：来自于早期胚胎嵴原始生殖细胞的多能干细胞。EC细胞：来自于自发或诱发的生殖细胞瘤或畸胎瘤中的多能干细胞。干细胞技术又名干细胞治疗，是从20世纪末期在世界范围内开始研究的一种医疗技术。其方法是利用人体干细胞的分化和修复原理，把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。截至到2012年，干细胞技术仍存在很多未知和不确定的难题，因此，干细胞治疗技术还存在一定风险。2012年1月，中国卫生部发出通知，停止一切未经卫生部和国家食药局批准的干细胞临床研究和应用活动。二、ES/EG细胞培养建系技术ES细胞建系：将早期胚胎（桑椹胚或囊胚）与抑制分化物共培养，使之增殖并保持未分化状态，随着传代数的增多，细胞数量越来越多，直到建立ES细胞系。•（一）、ES细胞的分离•（二）、饲养层细胞饲养法•（三）、无饲养层培养•（四）、ES细胞的原代培养和继代培养•（五）、ES/EG细胞系的特性和鉴定EG细胞建系：EG细胞在体外培养增殖能力较ES细胞弱，所需条件特别是饲养层较ES细胞严格，所以EG细胞培养建系较ES细胞困难。1.全胚培养法将桑椹胚或囊胚直接培养在饲养层上，自然脱去透明带，贴壁，与滋养层细胞一起增殖。当ICM增殖垂直向上生长一定时间后，挑出ICM，并离散成小细胞团块，继代培养，克隆增殖。2.免疫外科ICM培养法：先用链酶蛋白酶将胚胎的透明带除去，裸胚在抗体中处理一段时间，再在补体中作用一段时间，使滋养层细胞发生溶解，然后直接对ICM进行培养和扩增。3.机械剥离ICM培养法：采用机械法除去胚胎滋养层细胞来分离培养ICM。4.克隆法：将（转基因）成纤维细胞注入去核哺乳动物卵母细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂至桑椹胚或囊胚。分离ES细胞与全胚培养法相同MEF饲养层细胞培养法的分离与培养2.MEF饲养层的制备1.MEF的分离与培养妊娠12~14天母鼠胎儿干部剪碎消化离散细胞离心制细胞悬液计数培养制成单细胞悬液传代培养断颈处死无菌去除头、四肢、内脏、尾眼科剪0.25胰酶+0.04EDTA37、10~15min1000r/min、5min细胞培养液37、5CO2、饱和湿度0.25胰酶+0.04EDTA2.MEF饲养层的制备1.取生长旺盛的培养皿+死裂霉素C10μg/mL处理2~3h2.吸去处理液，清洗，制成单细胞悬液（0.25胰酶+0.04EDTA）3.细胞计数并调整浓度为3.0104.在6孔培养板中每孔加入0.6mL细胞悬液37、5CO2的培养箱内培养原理在细胞培养液中添加ES细胞抑制因子使ES细胞在体外培养环境下保持未分化状态（三）、无饲养层培养扩张囊胚或孵化胚分离ICM细胞挑取形态典型的ICM集落转入ES细胞培养液中进行剥离转入培养基进行培养实体显微镜下用0.25％胰酶和0.04％EDTA消化液消化3~5min用孔径适当的吸胚管吹打成单细胞或小细胞团制备好MEF饲养层并添加相应的ES细胞培养液，隔日将囊胚置入培养（37、5%CO2和饱和湿度）。离散的ICM或ES细胞重新接种饲养层后，可出现各种细胞集落，挑选生长良好，没有分化迹象的ES/EG集落进行消化扩增。用胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，一般间隔4～5天用胰蛋白酶消化成小细胞团块或单细胞，克隆和纯化ES细胞。ES/EG的亚克隆对外界条件的要求十分苛刻，如PH，酶，温度，培养液成分，细胞密度以及冷冻复苏等体外不稳定环境因素均影响着ES细胞的分离和克隆。.ESES初次传代后2～3天将出现小的ES细胞集落。待ES细胞集落充分增值而不出现分化时重新离散，转入新鲜饲养层上。经数次分离纯化后，ES细胞逐渐扩增，后面每隔4～6天传代一次。对ES/EG细胞进行消化传代总的原则是尽量缩短酶消化作用时间，将细胞的损伤降到最低程度且能将集落消化成小细胞团块（图15-3）。ES在ES细胞传代过程中，因其耐受性差需不断对细胞行冷藏。方法为取对数生长期的ES单细胞悬浮液放入冷冻液中。冷冻液为75%DMEM+15%新生牛血清（NCS）+10%二甲基亚砜（DMSO）冷冻开始温度下降速度保持在13/min为宜，当温度下降到-20左右时下降速度可调为5/min,到-100左右时，可迅速投入液氮。解冻时，从液氮中将冷冻管取出37水浴中直到溶解70%的酒精消毒冷冻管外壁加入ES细胞培养液离心2次除去冷冻液弃去上清液，以培养液重新悬浮细胞再放入CO2培养箱培养。（五）、ESEG细胞的鉴定方法ES细胞的鉴定方法有形态学特征、核型分析、碱性磷酸酶染色、分化能力检测等。形态结构：胞体体积小，核大、有一个或几个核仁生长特性：呈克隆状生长，细胞紧密聚集，形似鸟巢，彼此界限不清ESC具有正常二倍体核型，可用核型分析进行检验。三、干细胞应用（治疗失明）首例利用胚胎干细胞医治失明手术在美实施2011年7月15日据美国《》及《技术评论杂志》，美国于近日正式进行了首例以人类胚胎干细胞医治渐进式失明患者的手术。这是美国食品和药物管理局（FDA）批准的第二起人类胚胎干细胞人体临床试验。而 本次手术治疗备受重视，被认为是干细胞领域的重要里程 碑，或将使饱受争议的人类胚胎干细胞研究证明其真实价 值。位于麻省的先进细胞科技公司 （Advanced Cell Technology）于当地时间7月14日宣布 了该消息。该公司首席科学官、美国最著名干细胞研究学 者罗伯特兰萨在声明中指出：“干细胞的巨大潜力最终 将被推上检验台。而两例临床试验的启动，成为该领域的 一个重要转折标志。” 医生手持的针筒中装有由干细胞培 育而成的视网膜色素上皮细胞。 手术现场 利用动物干细胞 培育出视网膜组织 2012年6月14日日本再生科学综合研究中心教授 笹井芳树领导的研究小组利用动物干细胞培育出 视网膜组织，并发表在最新一期杂志《干细胞》 上。研究小组利用小鼠的胚胎干细胞，成功地在 试管中培养出了被称为“视杯”的视网膜组织， “视杯”是胚胎发育初期形成的视网膜结构。研 究人员将“视杯”再持续培养两周后，形成了接 近新生小鼠视网膜的组织。视网膜含有多种细胞 的复杂构造双赢彩票官网干细胞技术 - 豆丁网，在以往的胚胎干细胞培育技术中， 从未培育出如此复杂的组织。 技术先进性 实现转基因定点整合 (一)基因打靶的原理 基因打靶(gene targeting)是根据 DNA同源重组的原理而设计的一项技术。 在这一技术中，体内细胞基因组的某一段 DNA序列被视为“靶子”，经精巧构建 的欲导入的外源基因DNA序列被视为 “弹头”，这样导入的外源基因进入受体 细胞后就不再是随机整合而是“弹头”锚 准“靶子”进行准确的定点整合。 (targeting vector) 如何使外源基因能定点整合于靶基因上呢? 根据DNA同源重组的原理，导入的外源基因必 须和靶基因有一定的同源序列。因此，外源基因 导入前必须经过精巧的构建，经构建的外源基因 称为打靶载体(targeting vector)。 ES细胞 (1)基因击入(gene knock-in) 在受体细胞基因组中定点引入一个完全新 的基因。 (2)基因敲除(gene knock-out) 受体细胞内源靶基因被灭活,。 (3)基因替代(gene replacement) 靶基因被导入的外源基因替代，可以是以 正常基因替代突变的内源基因。 进行基因打靶要经历以下步骤： （1）构建打靶载体。 （2）打靶载体导入受体细胞(常用胚 胎干细胞(embryonic stem cell，即ES 细胞)。 （3）打靶ES细胞导入囊胚。 （4）囊胚植入假孕母鼠子宫发育。 基因打靶的关键在于构建打靶载体。在打 靶载体中需要一个与靶基因同源的DNA片段， 这一片段称为同源重组指导序(homologous recombination directing sequences, HRDS)。外源基因插入这一同源序列之中。 长度可从3kb至15kb。 通过同源重组将外源基因导入固定位点,从而有目的的突变内源基 因，图中单线表示内含子，框图表示外显子 打靶载体野生ES细胞 突变ES细胞 基因打靶所使用的受体细胞一般用胚 胎干细胞(ES细胞)，ES细胞是一种多潜能 的干细胞，能在体外传代而不改变其多潜 能性。小鼠胚胎干细胞是从着床前胚胎(孕 －5天)内细胞群分离的细胞dLsct.com。1981年由英国剑桥大学的Evans和 Kaufman首先分离培养成功。 英国卡迪夫大学(Cardiff University) 卡迪夫生命科学学院Martin Evans外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法 外源基因导入ES细胞与否，还需经 过G418和GANC培养基筛选。由于同源重 组的频率很低，因而筛选并富集真正发生了 同源重组的细胞是至关重要的。筛选可采用 正负选择法。实现基因打靶的ES细胞能抵 抗G418 而不能利用GANC。 G418 GANC 导入外源基因的阳性ES细胞的筛选 正负选择法的原理 在构建打靶载体时，打靶载体含有一段与靶 基因同源的序列，将新霉素抗性基因(neo )插入到该同源序列的第一个外显子中作为正选择标 （或者是靶基因最关键的外显子中）； neo 可以抵抗G418.在同源序列之外的末端接上单纯疱疹病 毒胸腺嘧啶激酶(HSV－tk)基因序列作为负选择标 志。。HSV-tK可以利用GANC而导致细胞死亡。。 Hsv-tkneo 同源重组（基因打靶Gene Targeting） 如果导入的外源基因与靶基因发生同源重组， 外源基因以及neo 基因将整合于靶细胞基因组的同源序列位点上，而位于同源序列末端外的HSV tk基因则在重组后丢失，此种情况下标志基因只有neo 基因表达，则靶细胞同时具有G418和GANC双重抗性可在 选择性培养基中存活下来。 随机整合(Random Integration） 如果导入的外游基因与细胞基因组随机整合， 打靶载体将从头至尾全部整合入靶细胞基因组中，dLsct.com。