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　　干细胞技术研究进展与应用干细胞技术研究进展与应用胚胎干细胞（ESC)技术的基本方法[1]：胚胎干细胞研究应用的第一步是建立体外胚胎干细胞系。有两种方法，其一是来自受精卵的精卵细胞体外受精，在囊胚期取内部的愈伤组织于培养基中培养，经干细胞克隆可分别分化为心肌、血液、神经、骨髓、皮肤等干细胞。其二是体细胞核移植技术，通过该技术将其体细胞的细胞核显微注射至去核的人卵细胞中，这种包含与供体完全相同遗传物质的复合卵细胞在体外培养发育成胚胎。成体干细胞（ASC)技术的基本方法[2]：对ASC的研究还只是初级阶段,除造血干细胞外,分离、提纯极微量的其它组织的ASC技术问题尚未完全解决。骨髓ASC胞(MSC)的分离,目前最常用的方法是将骨髓细胞进行密度梯度离心分离,收集低密度细胞层接种于MSC标准培养液中5~7d后观察到有梭形细胞粘附于塑料培养板表面,这就是MSC通过换液除去未贴壁细胞后进行传代培养,接近融合的细胞可用胰酶消化。干细胞技术的应用3.1干细胞技术在水生动物领域的应用鱼类胚胎干细胞的培养研究已经从小型模式种类（如青鳉和斑马鱼）扩大到养殖种类。Chen等[3]从海水养殖鲈鱼（Lateolabraxjaponiucs)囊胚期受精卵获得干细胞并建成一个多能细胞系(LJES1)，该研究显示,通过培养的胚胎干细胞进行遗传操作进而培育鱼类新品种具有广阔前景。硬骨鱼类成体视网膜对研究脊椎动物中枢神经系统持续的和损伤诱导的神经发生是一个重要的模型。大量证据表明那些为视网膜边缘和视干细胞提供神经元的祖细胞就来自多能干细胞而且在视网膜中与生长关联的神经发生的行为部分是由生长激素/-I轴调节的。海洋扁形动物(neoblasts)干细胞是多能的(很可能是全能的)未分化细胞在成体生活期间具有增殖能力所有的体细胞和生殖细胞都来自干细胞。用胸腺嘧啶脱氧核苷类似物——5-溴-2-脱氧尿苷（BrdU)Macrostomumsp.S-期细胞,发现S-期细胞就是neoblasts,分布于身体两侧的带状区域而身体中轴线附近和眼前部区域没有标记细胞。这一结果与用抗磷酸化组蛋白H3抗体显示有丝分裂细胞的分布是一致的。BrdU标记还表明上皮细胞的更新非常频繁。在海绵动物干细胞的研究中,使用了来自Suberitesdomuncula切碎的约1mm3小块组织(primmorphs),培养在有或形态发生因子无硅酸盐和三价铁离子的培养基中(RPMI1640/seawater)。在primmorphs中发现2个编码基因,他们编码的蛋白质出现于高等后生动物的干细胞。一个是noggin基因,在两栖类组织者出现；另一个基因编码间质干细胞样蛋白。在有硅酸盐和三价铁离子的培养基中，primmorphs中noggin的表达显著上调,而后者表达被抑制。干细胞技术能够渗透进海洋动物研究的许多方面。将胚胎干细胞技术与基因打靶技术结合起来可对基因组进行定点操作,从而获得遗传改良的水产养殖新品种。若把海洋药用动物的干细胞大规模培养后定向分化为可分泌活性物质的功能细胞,则可解决目前困扰世界海洋生物制药产业的瓶颈海洋药源生物严重不足的问题。若把高级食用水产动物的干细胞扩增后分化为具有特殊风味的细胞则可作为食品添加剂。可以预计,干细胞理论和技术将极大地推动水生生物学诸多领域的发展,具有重要的理论和实践意义。[4]3.2干细胞技术在运动医学领域的应用3.2.1利用干细胞技术治疗运动骨关节、肌肉损伤研究表明,成体骨髓储存着两类不同的干细胞:造血干细胞(haematopoieticstemcell)与基质干细胞(stromalstemcell)。前者是血细胞与破骨细胞的起源,后者则是成骨细胞的祖先。基质干细胞具有向多种组织细胞类型分化的能力干细胞技术研究进展与应用。基质干细胞参与体内骨重建,这在动物模型上已获得充分的证据。顾祖超等[5]采用骨髓穿刺、密度梯度离心法获取兔骨髓基质细胞,经体外诱导分化,接种到聚磷酸钙纤维/L-聚乳酸/胶原支架材料上,植入自体尺骨中下段1.5cm长的骨膜骨缺损区,结果术后周缺损区为新生骨样组织充填,血循环丰富,12周时形态结构己接近正常骨组织；随修复时间延长,复组织的力学性能逐渐增强。应用干细胞技术无疑拓展了组织再生与修复研究的新领域,为运动骨关节损伤组织再生、修复创造新途径。同样,将骨骼肌卫星细胞迁移到损伤组织,可以促进肌组织再生和修复的过程而治疗骨骼肌损伤。3.2.2利用干细胞技术治疗脊髓损伤利用干细胞技术治疗脊髓损伤利用神经干细胞作为治疗脊髓损伤的策略是近年来研究的热点之一。神经干细胞的发现为神经发育研究、神经系统功能重建和神经再生提供了新思路。近年研究表明体内移植神经干细胞在修复和治疗损伤的中枢神经及退行性疾病等方面有潜在的应用价值。就目前的技术水平而言移植可能是修复受损中枢神经系统更为可行的途径。Christopher[6]研究发现神经干细胞移植到中枢神经系统后仍可增殖并分化成具有适当表型的神经细胞。目前已有胚胎干细胞或胚胎神经干细胞移植治疗脊髓撞击伤的成功报道。3.2.3利用干细胞技术治疗心肌损伤利用干细胞技术治疗心肌损伤目前利用干细胞技术治疗心肌损伤主要集中在骨髓、骨骼肌和血液来源的干细胞。Anversa[7]将小鼠骨髓中Lin-/c-kiL细胞注射入心肌梗塞小鼠后,结果发现移植细胞占梗死心肌的68%,并且形成了心肌细胞和血管组织,心脏功能有33%的改善。干细胞动员治疗以其方便、无创、易开展的特性将为缺血损伤的心肌治疗带来新的希望,并克服了开胸手术带来的创伤及风险。此疗法的机制阐明和推广应用也将为组织再生治疗开辟新的前景。这项重大研究成果为治疗过度训练导致心肌坏死和心肌缺血造成的损伤提供了一条新思路。3.3诱导性多潜能干细胞在临床的应用诱导性多潜能干细胞（iPS）为研究临床疾病的发病机制、发现新药物和新治疗方法以及开展个性化治疗方面提供了重要的技术支撑。制备疾病特异性干细胞长期以来都是再生医学领域的目标,而iPS细胞的出现使得该目标变成了一项常规操作,当前有大量报道将各种患者来源的细胞诱导成iPS细胞,其中神经系统疾病包括帕金森病(PD)、亨廷顿症HD)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)、脊髓性肌萎缩(SMA)、唐氏综合征等,血液系统疾病包括范可尼贫血、腺苷脱氨酶严重复合型免疫缺乏症(ADA-SCAD)、镰刀细胞型贫血、?-中海贫血等,代谢系统疾病包括1型糖尿病、IIIGD)等。这些细胞模型为深入研究疾病的发病机制、体外药物筛选、治疗效果评价方面提供了一个非常有用的技术平此外,在细胞替代治疗方面,iPS细胞由于不存在异体移植免疫排斥以及后续必须应用抗排斥反应药物的问题,具有广阔的临床应用前景。通过诱导iPS细胞定向分化,然后将细胞移植到特定部位发挥作用,用于治疗疾病。[8]3.4干细胞技术在治疗其他疾病的应用干细胞还可以治疗糖尿病、白血病等。干细胞除了直接 使用之外，将来还可能配合基因修饰，提供原有干细胞不具 备的功能，使其成为人造器官组织的来源。目前来 源有限，因此干细胞的潜力备受期待。另外，利用人类干细 胞或其衍生的组织、器官测试各种药物的药效、毒理特性， 也会比用其他动物更能反映人体状况，可能发展成为一种新 的药物筛选模式。干细胞应用于临床治疗，最大的挑战在于 稳定的细胞来源、足够的移植细胞量，以及能维持细胞活性 的保存技术。目前干细胞的分离、纯化与收集技术，可以说 是取得治疗材料的关键，而生物体外细胞工程与选殖、细胞 株的增生培养，以及治疗产品的制造，都是此一治疗所需的 重要相关技术。 小结虽然干细胞技术有着诱人的前景，但其要应用于临床还 要面临许多问题。首先是技术上的问题，例如如何克服免疫排斥反应，体外控制干细胞分化方向技术尚未完全成功。还 有就是对于胚胎干细胞应用时的道德伦理问题，争论不休。 如果能正确引导，干细胞技术将推动生物医学深刻的革命， 给人类带来更多的福音。